大車前苷對糖尿病大鼠腎纖維化的干預作用

梁霄， 王盼， 李濤， 牛昭， 陳婧

（1.保定市第二醫院腎內科風濕免疫科，河北保定 071000；2.河北大學附屬醫院病理科，河北保定 071030；3.保定市第二醫院檢驗科，河北保定 071000；4.保定市第二中心醫院腫瘤科，河北保定 071000）

糖尿病腎病是全球范圍內終末期腎衰竭發生的主要原因[1-2]。與糖尿病腎病相關的特征性功能和結構異常包括蛋白尿、腎小球瘢痕化、腎間質纖維化以及腎臟功能持續下降[3-4]。對抗腎纖維化是減輕糖尿病腎病的內在機制[5]。有研究發現，大車前苷可以抑制高糖誘導的腎系膜細胞的炎癥、氧化應激和細胞外基質累積[6]，對鎘處理大鼠的腎臟有保護作用[7]。但體內大車前苷對糖尿病腎病的影響及機制尚不清楚。因此，本研究探討了大車前苷對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠腎功能和病理的影響及機制，以期為糖尿病腎病的臨床治療提供參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物新生的SD大鼠36只，雌雄各半，懷孕1周的SPF母鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號：SCXK（京）2016-0006。SPF實驗動物飼養室溫度控制在21℃左右、濕度控制在55%左右，光照∕黑暗周期為12 h。大鼠在實驗前均予普通飼料適應性喂養1周。該實驗方案已經保定市第二醫院動物倫理委員會審批，符合動物倫理原則。

1.2 藥物與試劑大車前苷[分子式為C29H36O16，分子量：640.59，高效液相色譜（HLPC）≥98.0%]購自上海吉至生化科技有限公司，批號：104777-68-6；二甲雙胍（Melbine，HLPC≥97.0%）購自江順化工科技有限公司，批號：1115-70-4。鏈脲佐菌素（STZ，HLPC≥98.0%）購自北京賽因百奧生物技術有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑購自索萊寶科技有限公司；丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽轉移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）等檢測試劑盒均購自上海江萊生物科研試劑有限公司；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解緩沖液（南京海克爾生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海易色醫療科技有限公司）；兔來源的TGF-β、α-SMA、E-cadherin、Smad3、Smad2、Smad7等單克隆抗體和山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.3 儀器Urtest-500B尿液分析儀，購自桂林優利特醫療電子銷售有限公司；MuLTI?SKANGO型全自動酶標儀，購自美國Thermo公司；HCC400全自動生化分析儀，購自山東國康生物科技有限公司；FluorChem HD2凝膠成像系統，購自美國Proteinsimple公司。

1.4 分組、模型構建與給藥處理將新生大鼠隨機分為正常組，模型組，大車前苷低、中、高劑量組，二甲雙胍組，每組6只。模型組，大車前苷低、中、高劑量組，二甲雙胍組大鼠出生第2天給予腹膜內單次注射STZ 50 mg∕kg復制糖尿病模型[8]，正常組給予腹腔注射等量0.1 mol∕L檸檬酸鹽緩沖液。第8周后，大鼠斷奶并測定血糖水平，血糖高于250 mg∕dL即可判斷為造模成功[9]。大鼠再飼養4周后，大車前苷低、中、高劑量組大鼠分別對應灌胃大車前苷10、20、40 mg·kg-1·d-1[7]，二甲雙胍組灌胃二甲雙胍25 mg·kg-1·d-1[10]，持續4周，即第12~16周。實驗最后1天，收集24 h尿液，麻醉后收集血液樣本和腎組織。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 血液生化分析經大鼠眼眶采集血液，分離血清。應用全自動生化分析儀檢測大鼠血糖含量及總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、胰島素、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）水平。

1.5.2 尿液生化分析第16周實驗結束最后1天，收集24 h尿液，應用尿液分析儀檢測尿蛋白（PRO）、尿潛血（BLO）和尿膽紅素（BIL）的含量。

1.5.3 HE染色法觀察腎臟病理變化將腎組織用40 g∕L多聚甲醛溶液固定后，常規脫水制成石蠟切片。然后進行脫蠟、蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化、0.6%氨水返藍、0.5%伊紅染色、常規脫水、二甲苯透明等步驟，最后以中性樹膠封片。于400倍顯微鏡下觀察腎損傷情況。

1.5.4 腎組織MDA、GSH、GPx、GST、SOD檢測將腎組織勻漿，收集上清液。按照試劑盒說明書檢測MDA、GSH、GPx、GST、SOD水平。

1.5.5 免疫組織化學法檢測腎組織TGF-β表達將腎組織石蠟切片常規脫蠟，用過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶活性，再加入TGF-β抗體（1∶800稀釋）4℃孵育過夜，然后滴加生物素標記的二抗，以3，3’-二氨基聯苯胺DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后封片觀察。實驗均采用刪除第一抗體作陰性對照。TGF-β表達陽性則呈棕色顆粒狀，應用真彩色病理圖像分析系統軟件計算陽性指數（PI）。

1.5.6 蛋白免疫印跡法檢測腎組織α-SMA、E-cadherin、TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7蛋白表達將腎組織剪碎，用RIPA裂解液勻漿提取總蛋白，然后用BCA試劑盒定量蛋白的濃度。將蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，再用半干轉膜儀轉移到聚偏二氟乙烯膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉蛋白2 h。分別加入一抗稀釋液α-SMA（1∶1 000）、E-cadherin（1∶800）、TGF-β（1∶1 000）、Smad2（1∶1 500）、Smad3（1∶1 500）、Smad7（1∶1 500）4℃封閉過夜。再加入對應辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆IgG二抗稀釋液（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴增強化學發光（ECL）試劑曝光、顯影。以GAPDH為內參，使用ImagePro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶積分吸光度值，結果以目標蛋白積分吸光度值∕內參蛋白積分吸光度值表示。

1.6 統計方法采用SPSS21.0統計學軟件進行數據分析。所有實驗數據以均數±標準差（±s）表示，經Shapiro-Wilk檢驗發現符合呈正態分布，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血液生化指標比較與正常組比較，模型組大鼠血糖含量及TC、TG、BUN、SCr水平均顯著升高（P<0.01），而胰島素、TP和ALB水平均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠血糖含量及TC、TG、胰島素、TP、ALB、BUN、SCr水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血糖含量及TC、TG、BUN、SCr水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），而胰島素、TP和ALB水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。具體結果見圖1。

圖1 各組大鼠血液生化指標比較Figure 1 Comparison of blood biochemical parameters in rats of various groups

2.2 各組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量的比較與正常組比較，模型組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量均顯著增多（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。具體結果見圖2。

圖2 各組大鼠尿液中PRO、BLO和BIL含量的比較Figure 2 Comparison of PRO，BLO and BIL levels in urine of rats in various groups

2.3 各組大鼠腎組織病理變化的比較正常組大鼠腎小管和腎小球形狀規則，未觀察到增生性腎小球基底膜。模型組腎小球系膜增生明顯，腎小球基底膜增厚，腎小球包膜收縮，毛細血管堵塞，腎纖維化明顯。大車前苷中、高劑量和二甲雙胍組大鼠腎組織病理損傷明顯減輕，大車前苷低劑量組改善不明顯。具體結果見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織病理變化比較（HE染色法，×400）Figure 3 Comparison of pathological changes of renal tissue of rats in various groups（by HE staining method，×400）

2.4 各組大鼠腎組織氧化應激水平的比較與正常組比較，模型組大鼠腎組織MDA水平顯著升高（P<0.01），GSH、GPx、GST和SOD水平均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠腎組織MDA、GSH、GPx、GST和SOD水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織MDA水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），GSH、GPx、GST和SOD水平均顯著升高（P<0.05，P<0.01）。具體結果見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織氧化應激水平的比較Figure 4 Comparison of oxidative stress levels in renal tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠腎組織TGF-β、E-cadherin和α-SMA表達比較與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β的PI值顯著升高（P<0.01），E-cadherin表達水平顯著下調（P<0.01），α-SMA表達水平均顯著上調（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠腎組織TGF-β的PI值、E-cadherin和α-SMA表達水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織TGF-β的PI值顯著降低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin表達水平顯著上調（P<0.05或P<0.01），α-SMA表達水平均顯著下調（P<0.05或P<0.01）。具體結果見圖5。

圖5 各組大鼠腎組織TGF-β、E-cadherin和α-SMA表達比較Figure 5 Comparison of expression of TGF-β，E-cadherin andα-SMA in renal tissue of rats in various groups

2.6 各組大鼠腎組織TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7表達比較與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β、Smad2和Smad3表達水平顯著上調（P<0.01），Smad7表達水平均顯著下調（P<0.01）；與模型組比較，大車前苷低劑量組大鼠腎組織TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7表達水平均無明顯變化，大車前苷中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織TGF-β、Smad2和Smad3表達水平顯著下調（P<0.05或P<0.01），Smad7表達水平均顯著上調（P<0.05或P<0.01）。具體結果見圖6。

圖6 各組大鼠腎組織TGF-β、Smad2、Smad3和Smad7表達比較Figure 6 Comparison of expressions of TGF-β，Smad2，Smad3 and Smad7 in renal tissue of rats in various groups

3 討論

常用中藥車前草為車前科植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥全草。味甘，性寒。歸肝、脾經，具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒等功效，用于治療水腫、熱淋澀痛、暑濕瀉痢、吐血衄血、癰腫瘡毒等病癥。大車前苷為車前草的專屬成分。本研究結果顯示，大車前苷可顯著降低糖尿病大鼠血糖含量及TC、TG、BUN、SCr水平，升高胰島素、TP和ALB水平，減少尿液中PRO、BLO和BIL含量，減輕腎組織病理損傷。表明大車前苷可以改善STZ誘導的糖尿病大鼠病情，減輕糖尿病相關腎損傷，與二甲雙胍療效相當。

細胞外基質的異常累積，正是腎纖維化的主要特點[11]。α-SMA被認為是肌成纖維細胞的標志，與腎纖維化程度及腎臟疾病的進展呈正相關[12]。E-cadherin是腎小管上皮細胞的標記物，在細胞連接和極化中發揮重要作用，也是上皮間質轉化的標志蛋白，而上皮間質轉化是導致細胞外基質生成的重要環節[13]。本研究結果顯示，大車前苷可上調糖尿病大鼠腎組織E-cadherin表達水平，下調α-SMA表達水平，表明大車前苷可減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化程度。

TGF-β可啟動經典和非經典途徑發揮多種生物學效應。TGF-β被確定為腎纖維化的關鍵介質，它是一種纖維原性細胞因子，通過激活其下游介體Smad2和Smad3活性介導腎纖維化[14]。其中，Smad信號被公認為是TGF-β信號在進行性腎纖維化中的主要通路[15]。TGF-β1在結合其受體后通過磷酸化激活其下游介質Smad2和Smad3發揮其生物學作用。此外，活化的Smad2∕3與常見的Smad4形成異源復合物，并易位進入細胞核以結合并調節靶基因的表達[16]。在纖維形成的過程中，Smad3被高度激活，這與通過泛素E3連接酶依賴性降解機制下調抑制性Smad7有關[17]。Smad3和Smad7之間的平衡偏移導致肌成纖維細胞蓄積和活化，使細胞外基質過度生成，加劇腎纖維化[18]。另外，持續性糖尿病相關代謝和血液動力學擾動引起的腎臟炎癥及相關修復反應，激活諸如Smad3等纖維化促進蛋白，可最終導致腎纖維化[15]。本研究結果顯示，大車前苷能夠上調STZ誘導的糖尿病腎病大鼠腎組織Smad7，下調TGF-β、Smad2和Smad3表達，與腎纖維化減輕趨勢一致。因此，我們推測大車前苷可能是通過調節TGF-β∕Smad信號通路來減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化。

糖尿病腎病是由高血糖狀態和晚期糖基化終末產物在腎臟的積累引起的，氧化應激是糖尿病腎病的觸發因素。有研究發現，高葡萄糖刺激的腎小管上皮細胞，產生活性氧簇（ROS），促進TGF-β1表達增強，最終導致腎纖維化[13]。發生糖尿病時，氧化應激反應增強，可誘導腎組織細胞凋亡損傷，使其成為糖尿病腎病進展的主要潛在機制[19]。本研究結果顯示，大車前苷可降低糖尿病大鼠腎組織脂質過氧化物MDA水平，升高抗氧化酶GSH、GPx、GST和SOD水平，表明大車前苷可抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應激反應，從而減輕腎纖維化程度。

綜上所述，大車前苷可減輕STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟損傷和纖維化，其機制可能與調節氧化應激反應和TGF-β∕Smad信號通路有關。