補腎解毒方對放射后小鼠血清白細胞介素6、白細胞介素10和外周血白細胞的影響

余雷， 楊云霜， 曹慧敏， 李延暉， 鄒夢穎， 劉曉辰， 張蓉

（1.火箭軍特色醫學中心中醫與康復醫學科，北京 100088；2.蘇州大學，江蘇蘇州 215000；3.火箭軍特色醫學中心醫研部，北京 100088）

隨著放射技術的高速發展，人們在享受它帶來豐富受益的同時也面臨著放射性損傷。長期的放射暴露容易造成免疫損傷，引起炎癥反應，炎性因子對臨近細胞造成影響，進而又加劇機體組織損傷。白細胞介素（IL）6是重要的促炎因子，IL-10為多效抗炎細胞因子，它們的動態變化反映了機體的炎癥水平及免疫狀態[1]。補腎解毒方為火箭軍特色醫學中心醫研部張蓉博士自擬方劑，旨在研發出一種新型、低毒的放射防護劑。本課題組前期研究發現該方能減輕放射后胸腺、脾等免疫器官損傷[2-3]。細胞因子是重要的炎癥介質和免疫調節因子，因此，本研究觀察補腎解毒方對放射后小鼠血清IL-6、IL-10分泌水平的調控作用，同時觀察其對受損白細胞的保護作用，探討放射后補腎解毒方的抗炎抗損傷作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物72只SPF級C57BL∕10J小鼠，7~8周齡，體質量（23±3）g，由南京大學生物醫藥研究院培育，動物生產許可證號：[SCXK（蘇）2018-0008]。于北京師范大學生命科學院實驗動物中心飼養，溫度25℃，濕度50%，提供正常光照條件，所有動物均可自由進水攝食。

1.2 藥物補腎解毒方，方劑組成：熟地黃10 g，牡丹皮10 g，山萸肉12 g，茯苓10 g，山藥10 g，冬蟲夏草3 g，澤瀉10 g，白花蛇舌草10 g。由康仁堂藥業有限公司配制成中藥顆粒制劑。將顆粒制劑與生理鹽水混合后加熱，配制出濃度為1.38g∕mL的混懸液，以備灌胃。

1.3 輻射源60Coγ-輻射裝置，由北京師范大學提供，北京伽瑪高新有限公司生產，型號：GM-11-03-A。

1.4 主要試劑與儀器IL-6酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（規格型號：96T，購自北京瑞格博科技發展有限公司）；IL-10 ELISA試劑盒（規格型號：96T，購自北京瑞格博科技發展有限公司）。Thermo Multiskan MK3酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；CT15RT高速臺式冷凍離心機（上海天美科學儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）。

1.5 實驗動物分組及處理方法將72只小鼠按隨機數表分為3組，即空白對照組、單純放射組、放射+中藥組，每組24只。適應性飼養3 d后開始給藥。參照人體給藥劑量（13.5 g∕kg），按公式轉換為小鼠給藥劑量[4]。放射+中藥組每日予以補腎解毒方湯劑1.54 g∕mL灌胃0.2 mL，1次∕日，空白對照組和單純放射組給予等體積（0.2 mL）生理鹽水灌胃。連續灌胃第11天，除空白對照組外，其余小鼠全部接受與照射源同等距離的一次性4 Gy60Coγ-射線全身照射。照射后各組每日繼續灌胃至實驗結束，方法同前。共灌胃25 d。并于照射后第1、7、14天取材，每組隨機抽取8只，稱其體質量，并眼球取血處死，分離血清。

1.6 血清IL-6、IL-10水平測定收集血液上清，采用ELISA法，嚴格按照試劑盒操作步驟進行，根據標準曲線的回歸方程，計算出小鼠血清IL-6、IL-10水平。

1.7 血清白細胞數應用全自動生化儀檢測白細胞數。

1.8 統計方法數據分析采用Graphpad Prism 5.0軟件，數據描述使用均數±標準差（±s），3組間比較采用兩因素方差分析，兩兩比較使用Tukey法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況比較小鼠在照射后一般情況均較照射前差，具體表現為體質量減輕、活躍度下降、精神狀態不佳、皮毛光澤度下降，尤其單純放射組程度更甚，5只小鼠出現毛發塊狀脫落的癥狀。

2.2 各組小鼠照射后體質量變化比較表1結果顯示：照射后第1天，小鼠體質量各組間差異無統計學意義（P>0.05）；照射后第7天，單純放射組小鼠體質量低于空白對照組和放射+中藥組（P<0.05或P<0.01）；照射后第14天，單純放射組小鼠體質量低于空白對照組（P<0.01），放射+中藥組小鼠體質量與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 各組小鼠體質量變化比較Table 1 Comparison of body mass changes of mice in various groups （±s，g）

表1 各組小鼠體質量變化比較Table 1 Comparison of body mass changes of mice in various groups （±s，g）

①P<0.01，與同時間點空白對照組比較；②P<0.05，與同時間點單純放射組比較

組別空白對照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天26.07±1.27 23.19±1.52①24.67±1.65鼠數（只）888照射后第1天24.29±1.96 23.58±1.26 23.91±1.44照射后第7天25.32±2.24 21.98±1.75①24.09±1.73②

2.3 各組小鼠照射后血清IL-6水平比較表2結果顯示：照射后第1天，單純放射組血清IL-6水平高于空白對照組（P<0.01），放射+中藥組血清IL-6水平低于單純放射組，但差異無統計學意義（P>0.05）；照射后第7、14天，單純放射組血清IL-6水平高于空白對照組和放射+中藥組（P<0.01），而放射+中藥組血清IL-6水平與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 Level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

表2 各組小鼠血清IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum IL-6 Level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

①P<0.01，與同時間點空白對照組比較；②P<0.01，與同時間點單純放射組比較

組別空白對照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天21.68±1.77 32.14±3.92①22.15±3.02②鼠數（只）888照射后第1天21.95±2.63 28.21±4.53①24.94±2.98照射后第7天22.14±2.8 32.22±4.33①24.71±2.88②

2.4 各組小鼠照射后血清IL-10水平比較表3結果顯示：照射后第1、14天，3組間差異無統計學意義（P>0.05）；照射后第7天，放射+中藥組IL-10水平高于空白對照組（P<0.01）。

表3 各組小鼠血清IL-10水平比較Table 3 Comparison of serum IL-10 level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

表3 各組小鼠血清IL-10水平比較Table 3 Comparison of serum IL-10 level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

①P<0.01，與同時間點空白對照組比較

組別空白對照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天101.33±6.59 110.37±8.47 111.68±9.71鼠數（只）888照射后第1天101.53±9.33 107.93±5.77 110.19±10.28照射后第7天102.11±7.97 108.37±9.28 113.55±9.87①

2.5 各組小鼠照射后外周血白細胞水平比較表4結果顯示：照射后第1、7天，單純放射組和放射+中藥組白細胞水平低于空白對照組（P<0.01），放射+中藥組白細胞水平高于單純放射組（P<0.05或P<0.01），與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；照射后第14天，單純放射組白細胞水平低于空白對照組（P<0.01），放射+中藥組白細胞水平高于單純放射組，與空白對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

表4 各組小鼠外周血白細胞水平比較Table 4 Comparison of serum leukocyte level of mice in various groups（±s，×109個·L-1）

表4 各組小鼠外周血白細胞水平比較Table 4 Comparison of serum leukocyte level of mice in various groups（±s，×109個·L-1）

①P<0.01，與同時間點空白對照組比較；②P<0.05，③P<0.01，與同時間點單純放射組比較

組別空白對照組單純放射組放射+中藥組照射后第14天10.01±0.89 8.73±0.65①9.42±0.83鼠數（只）888照射后第1天10.07±0.87 6.52±0.75①7.67±0.72①②照射后第7天9.94±0.87 7.24±0.71①8.61±0.70①③

3 討論

長期暴露于中低劑量射線中引起的健康問題一直備受關注。在醫療領域，中西醫結合治療疾病的手段越來越多地在臨床中應用，尤其在腫瘤治療方面，化療患者都經受著不同程度的放射后遺癥。中藥能有效降低化療后副作用，減輕炎癥反應[5]，彌補了現代醫學的不足。目前，國內外應用中藥治療放射損傷越來越受到重視，而控制感染成為抗放射損傷的首要環節。

IL-6由巨噬細胞、成纖維細胞等產生[6]，是介導炎癥反應的重要細胞因子，是機體發生感染的重要指標[7]。本研究結果顯示，照射后第1天，單純放射組IL-6水平高于空白對照組，而放射+中藥與空白對照組無顯著性差異，表明照射初期，補腎解毒方即發揮了放射防護效應，通過抑制IL-6水平的升高減輕了機體炎性反應。Geginat和Jiang等[8-9]研究發現，急性炎癥期血清IL-6水平比CRP上升更早，是判斷炎癥程度及預后的重要指標。本研究結果顯示，單純放射組IL-6水平在照射后第1天顯著升高，與這一發現相符。照射后第7、14天，單純放射組高于空白對照組和放射+中藥組，表明照射后服用中藥，機體能繼續發揮抗感染作用，而單純放射組IL-6水平無降低趨勢，說明照射中后期，機體仍處于較活躍的炎癥狀態，自身修復機能難以遏制感染的發展，因此，放射后出現感染狀態需人為進行藥物干預，防止促炎因子過度表達爆發炎癥級聯反應[10]，同時這一現象也證實了研發高效中藥防護劑的重要性。

IL-10主要由輔助性T淋巴細胞（Th）2細胞產生，介導調節Th1∕Th2細胞平衡[11]，抑制促炎因子合成釋放，促炎因子與抑炎因子相互作用，維持體內炎性反應和免疫反應平衡[12]。本研究結果顯示，照射后第7天，放射+中藥組IL-10水平高于空白對照組和單純放射組，表明補腎解毒方通過上調IL-10水平，抑制促炎因子釋放而發揮抗炎作用，照射后單純放射組IL-10水平升高，但與空白對照組間差異無統計學意義，考慮到放射后炎性因子增加，IL-10作為主要的抑炎因子必然隨之增加。白細胞通常也被稱為免疫細胞，是外周血非常重要的一類細胞，在機體中擔負許多重任，包括吞噬異物并產生抗體，抵御病原體入侵等，它對射線敏感，接受輻射后白細胞水平會迅速下降。本研究結果顯示，放射+中藥組白細胞水平高于單純放射組，表明中藥有效減輕了放射所致白細胞減少，從而發揮免疫防護作用。

炎癥反應是照射后最常見的癥狀[13]，炎性因子對臨近細胞造成影響，進而又加劇機體組織損傷，中醫藥在治療感染方面具有其獨特的優勢。放射從中醫學角度可稱之為“火毒之邪”，易耗津傷陰，最損腎中真陰[14]。補腎解毒方由滋補腎陰基礎方六味地黃丸化裁而來。現代研究已證實，六味地黃丸具有調節機體免疫、抗腫瘤的作用[15]。加入白花蛇舌草以清熱解毒，可發揮抗感染免疫功能[16]。加入冬蟲夏草以補肺益腎，Jing Y等[17-18]發現它的有效成分蟲草多糖能激活網狀內皮系統，增強非特異性免疫。針對放射的“火熱”之性，諸藥合用擬成的補腎解毒方，可共奏扶正祛邪之功。

綜上所述，補腎解毒方通過抑制放射后IL-6分泌水平，提升IL-10水平，并減輕放射所致白細胞數減少，發揮抗炎抗損傷作用。促炎因子與抑炎因子的動態水平變化發揮著免疫調節作用[19]，其中IL-6和IL-10是它們的典型代表，補腎解毒方是否還能通過其他細胞因子發揮放射防護作用，需進一步探討。