黃芪多糖對乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷的修復機制

陳自泓， 黃可兒

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州白云山星珠藥業有限公司，廣東廣州 510931）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫的作用。現代藥理研究表明，由單味中藥黃芪研發的口服制劑黃芪精可以降低乙醇誘導的胃黏膜損傷小鼠胃黏膜損傷分數，有明顯的保護胃黏膜的作用[1]；還有研究表明，黃芪水煎液能明顯減輕胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷，對潰瘍的抑制具有一定的量效關系[2]。黃芪多糖是黃芪的主要成分之一，臨床上研究應用較廣泛，大量體內外實驗及臨床研究表明，黃芪多糖具有調節免疫力[3]、抗腫瘤[4]、降脂[5]、抗心力衰竭[6]等作用，但對其是否具有保護胃黏膜的作用及相關機制，則鮮有報道。半仿生提取法是張兆旺等[7-8]根據“化學成分等值不一定生物等效”提出的一種新興的提取技術。該技術既重視單體成分，又注重中藥復方的整體作用，可盡量多地保留有效成分，縮短生產周期。本課題組前期優化了半仿生提取的黃芪多糖的工藝[9]。本研究進一步探討半仿生提取的黃芪多糖改善乙醇誘導大鼠胃黏膜損傷的作用及機制，以期為闡明黃芪防治消化系統疾病的傳統應用提供科學理論依據，對指導臨床治療胃病中藥用藥及開發新藥提供一定的參考價值。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠50只，體質量180~220 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：44005800009586。飼養于廣州中醫藥大學動物實驗中心，動物實驗證號：00214897。飼養環境：溫度20~25℃，相對濕度40%~70%，晝夜節律12 h∕12 h，動物自由進食、飲水。

1.2 藥物黃芪藥材購自廣州采芝林藥業有限公司，經廣州中醫藥大學中藥鑒定研究室張丹雁教授鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根；胃乃安膠囊，由廣州白云山中一藥業有限公司生產，批號：Z00003。

1.3 試劑與儀器兔抗鼠B細胞白血病2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase-3）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；兔鏈霉親和素（Streptavidin）-辣根過氧化物酶（HRP）試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；SP-9001生物素標記山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）、3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）檢測試劑盒（北京中杉金橋有限公司）。SHA-B恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）；LXJ-IB低速大功率多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；LGJ-25C冷凍干燥機[四環福瑞科儀科技發展（北京）有限公司]；TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）。

1.4 黃芪多糖的半仿生提取稱取黃芪藥材200 g打粉，溶解于6 L模擬胃液中，在100℃條件下提取1 h，提取液離心取上清，得到模擬胃液提取液。沉淀溶于6 L模擬腸液中，在100℃條件下提取1 h，提取液離心取上清，得到模擬腸液提取液。合并模擬胃液提取液與模擬腸液提取液濃縮至相對密度約1.09，放冷。加入4倍量的95%乙醇，4℃靜置過夜，離心收集沉淀，無水乙醇、丙酮交替洗滌2次，溶解回收無水乙醇及丙酮干凈后冷凍干燥即得。

1.5 分組、造模與給藥適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為5組，分別為正常組，模型組，胃乃安組，黃芪多糖低、高劑量組，每組10只。黃芪多糖低、高劑量組分別給予半仿生黃芪多糖10 g∕kg（生藥量）和20g∕kg（生藥量）灌胃，胃乃安組給予3g∕kg胃乃安膠囊粉灌胃，正常組及模型組給予等體積的純凈水灌胃，1次∕d，連續2 d。末次給藥前全部大鼠禁食不禁水24 h。末次給藥2 h后，除正常組外，其余各組大鼠分別灌胃無水乙醇1.4 mL∕只誘導急性胃黏膜損傷。1 h后處死大鼠，開腹取胃。

1.6 大鼠胃黏膜損傷（肉眼）情況的測定胃黏膜損傷評分：沿胃大彎剪開，浸洗后，展開置于預冷的濾紙上，肉眼觀察胃黏膜損傷情況并拍照，并用卡尺對損傷部位進行測量。參考Guth標準[10]，進行胃黏膜大體評分：未出現明顯損傷，計0分；斑點糜爛，計1分；糜爛長度1 mm，計2分；糜爛長度1~2 mm，計3分；糜爛長度2~3 mm，計4分；糜爛長度3 mm，計5分。寬度＞1 mm時分值乘以2。各分值累計相加為該只大鼠胃黏膜損傷總分值。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察胃黏膜的病理學變化及評分剪取1 cm×0.3 cm條狀胃組織，置于中性福爾馬林緩沖液中固定24~26 h。經包埋、過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，切片，調整切片厚度為4μm。HE染色，封片。在光鏡下觀察及評分：通過黏膜損傷的深度與損傷占黏膜的面積評分，比較大鼠胃黏膜損傷程度的差異。損傷深度≤1∕3，計1分；1∕3＜損傷深度＜2∕3，計2分；損傷深度≥2∕3，計3分。1%≤損傷面積＜30%，計1分；30%≤損傷面積＜60%，計2分；60%≤損傷面積＜90%，計3分；損傷面積≥90%，計4分。光鏡下胃黏膜損傷指數=損傷深度評分×損傷面積評分。

1.8 采用免疫組織化學法檢測胃黏膜組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達將切片分別經二甲苯、乙醇洗脫，再經抗原修復后，用正常羊血清工作液封閉10 min，然后將配好的Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗工作液（1∶50稀釋）滴加在組織上，37℃恒溫箱中孵育2 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。在切片組織上滴加生物素標記山羊抗兔的二抗后，滴加HRP標記的鏈霉親和素結合的二抗，PBS洗滌3次，滴加DAB顯色液，PBS漂洗3次，滴加蘇木素，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。應用Image-Pro?Plus 6.0系統進行圖像分析，測定平均光密度（IOD）值。

1.9 統計方法采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。若數據方差齊，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法；若方差不齊，采用Dunnett’s檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠胃黏膜損傷（肉眼）分數比較圖1結果顯示：與正常組比較，模型組的肉眼胃黏膜損傷分數顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，胃乃安組，黃芪多糖低、高劑量組及胃乃安組肉眼觀察的胃黏膜損傷分數顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；黃芪多糖低、高劑量組肉眼觀察的胃黏膜損傷分數與胃乃安組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠胃黏膜損傷（肉眼）情況比較Figure 1 Comparison of gastric mucosal injury（by the naked eye）of rats in various groups

2.2 各組大鼠胃黏膜組織病理學形態比較圖2-A~E結果顯示：正常組大鼠胃黏膜組織細胞排列緊密、有序，細胞結構清晰，腺體完整；模型組大鼠胃黏膜上皮細胞脫落、壞死，腺體排列紊亂，黏膜下層水腫，炎性細胞浸潤，腺體擴張，有紅細胞外滲；胃乃安組可見少量上皮細胞脫落，損傷情況較模型組輕，黃芪多糖低、高劑量組損傷情況較輕。

圖2-F結果顯示：與正常組比較，模型組光鏡下胃黏膜損傷指數顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖低、高劑量組及胃乃安組光鏡下胃黏膜損傷指數顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；黃芪多糖低、高劑量組光鏡下胃黏膜損傷指數與胃乃安組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織病理學形態比較（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of pathological morphological features of gastric mucosa tissues of rats in various groups（by HE staining，×200）

2.3 各組大鼠胃黏膜組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達比較圖3~5結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪多糖低、高劑量組及胃乃安組大鼠胃黏膜組織中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；黃芪多糖低、高劑量組胃黏膜組織Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達水平與胃乃安組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠胃黏膜組織Bcl-2蛋白表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 3 Comparison of Bcl-2 protein expression in gastric mucosa of rats in various groups（by immuohistochemical method，×200）

3 討論

無水乙醇或高濃度乙醇作為一種高刺激性攻擊因子，當乙醇的濃度或攝入量超過胃黏膜可承受的范圍，將對胃黏膜正常的生理代謝環境產生一系列的影響，如促使胃黏膜屏障發生失衡、胃酸分泌失調、激發炎癥因子及炎癥細胞的浸潤和釋放、改變胃黏膜微循環狀態以及影響胃腸激素如一氧化氮（NO）與前列腺素（PGE2）的釋放、誘導細胞凋亡等，從而引起一系列胃黏膜的損害。而介導胃黏膜細胞凋亡可能是乙醇誘導胃黏膜生物性損傷的關鍵病理機制之一[11-14]。

胃黏膜細胞的凋亡及增殖是胃黏膜保護機制的重要方面。有關研究顯示，細胞凋亡與急性胃黏膜損傷的發生有密切關系[15]，細胞凋亡過度而細胞增殖受抑必將破壞胃黏膜的完整性，最終造成胃黏膜損傷。Bax和Bcl-2是目前已知的一對重要的正負細胞凋亡調節基因[16]。Bcl-2在有關凋亡的機制中被廣泛研究，Bcl-2定位于線粒體、內質網上，Bcl-2能通過控制線粒體膜通透性來調節細胞死亡，其能通過阻止細胞色素c從線粒體中釋放或者通過與凋亡激活因子結合來抑制Caspase活性及Bcl-2的過表達，減少活性氧簇（ROS）的產生，進一步減輕因ROS損傷而引起的細胞調亡[17]。

圖4 各組大鼠胃黏膜組織Bax蛋白表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 4 Comparison of Bax protein expression in gastric mucosa of rats in various groups（by immuohistochemical method，×200）

圖5 各組大鼠胃黏膜組織Caspase-3蛋白表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 5 Comparison of Caspase-3 protein expression in gastric mucosa of rats in various groups（by immuohistochemical method，×200）

Bcl-2抑制細胞凋亡，而Bax能與Bcl-2形成二聚體蛋白酶促進細胞凋亡。Bax位于細胞質中，當凋亡發生時，Bcl-2和Bax蛋白通過調節關鍵蛋白酶Caspase的激活來影響細胞存活。Caspase的激活最終導致細胞凋亡。該級聯反應的一個關鍵步驟是激活Caspase-3，在生理狀態下，Caspase-3以無活性pro-Caspase-3存在，當凋亡發生時，它會切割多種底物，如DNA修復酶、聚合酶[18]。可見，Bax、Bcl-2、Caspase-3的異常表達與胃黏膜細胞的凋亡密切相關。

本研究結果顯示：乙醇誘導大鼠胃黏膜上皮細胞脫落、壞死，腺體排列紊亂，黏膜下層水腫，炎性細胞浸潤，腺體擴張，有紅細胞外滲，胃黏膜損傷（肉眼與光鏡觀察）分數升高。進一步通過免疫組織化學實驗發現，與正常組比較，模型組胃黏膜組織Bcl-2表達降低，Bax和Caspase-3的表達升高。表明乙醇誘導成功致大鼠胃黏膜組織出現損傷與凋亡。

用半仿生法提取的黃芪多糖對乙醇誘導的胃黏膜損傷大鼠模型進行干預，結果發現，半仿生提取黃芪多糖對乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷具有防治作用，病理學表現為上皮細胞脫落減少、胃黏膜損傷減輕，并發現其可能通過升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達、降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達發揮保護胃黏膜的作用。另外，查閱文獻研究[19]也發現，黃芪多糖能通過降低ROS、丙二醛（MDA）和Bax的水平，抑制Caspase-3的活性，提高超氧化物歧化酶（SOD）等的表達保護人心臟微血管內皮細胞受到的缺氧損傷。故推測黃芪多糖可能是通過抑制細胞凋亡，從而發揮保護胃黏膜的作用。

綜上所述，半仿生提取黃芪多糖對乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷具有明顯的修復作用，可通過升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達來發揮作用。