響應(yīng)曲面法優(yōu)化富集桑葉γ-氨基丁酸工藝研究

靳迎春,湯彩云,姚 彤,屠 潔*,劉冠卉,劉 利,3,李 強

(1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212100) (2.江蘇科技大學(xué) 糧食學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212100) (3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室, 鎮(zhèn)江 212100)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種廣泛存在于細(xì)菌、植物和脊椎動物中的非蛋白質(zhì)氨基酸.動物體中的GABA是由三羧酸循環(huán)谷氨酸脫羧酶( glutamic acid decarboxylase，GAD)催化谷氨酸而成，被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)過程中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、鎮(zhèn)靜、減少失眠等功效[1].許多植物體內(nèi)也可通過GAD將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，通常植物組織中GABA含量比較低，范圍僅在3.1～20.6 μg/g，但是在鹽、機械損傷、低溫、高溫和低氧等非生物脅迫下，能夠顯著提高GABA含量，從而參與植物代謝，調(diào)節(jié)生命活動[2-3].溶液浸泡法方便易行，是眾多學(xué)者研究富集GABA常用的方法，在溶液中添加外源氨基酸，不僅造成了鹽脅迫環(huán)境，還可以形成低氧的逆境，共同作用激活GAD活性，從而使GABA含量增加.文獻(xiàn)[4]利用1%谷氨酸鈉溶液對茶葉浸泡處理10 h，發(fā)現(xiàn)茶葉中GABA含量顯著提升，達(dá)到0.624 mg/mL，為對照組的6.8倍.

桑樹在我國是一種重要的經(jīng)濟作物，為藥食兩用資源，在我國約有四千年的栽培歷史.目前在全國范圍均可見桑樹種植，其中主要集中在華南和西南地區(qū)，且在不同的地區(qū)具有典型的種質(zhì)資源[5].桑葉作為蠶桑資源的副產(chǎn)品，含有豐富的營養(yǎng)和活性物質(zhì)，具有降血糖、保護(hù)心血管、抗氧化、抗炎、提高免疫力等藥理作用[6].研究發(fā)現(xiàn)，桑葉中富含GABA，尤其在嫩葉中含量較高，平均含量為0.77 mg/g，顯著高于其他植物中GABA含量[7].文獻(xiàn)[8]對不同品種桑葉GABA含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)華南地區(qū)的典型種植資源育711品種的GABA含量顯著高于其他品種.育711作為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主選育的優(yōu)質(zhì)桑樹品種，具有高抗性、高發(fā)芽率、高品質(zhì)等優(yōu)點，目前育711主要用于養(yǎng)蠶業(yè)，研究多集中在大田栽培表現(xiàn)和調(diào)查經(jīng)濟性狀等方面，而對其桑葉活性成分沒有充分的開發(fā)利用[9].因此，利用育711品種桑葉，挖掘新的富集GABA的生物材料，以開發(fā)富含GABA的功能性食品和保健品，對拓寬我國桑葉資源創(chuàng)新型研究具有一定的現(xiàn)實意義.

文中以育711品種桑葉為原材料，采用谷氨酸鈉浸泡處理桑葉富集GABA.通過單因素和響應(yīng)面實驗對影響桑葉GABA含量的浸泡時間、浸泡溫度、谷氨酸鈉濃度等因素進(jìn)行考察，并獲得富集最佳工藝，為育711的深度開發(fā)提供一定理論依據(jù).

1 實驗

1.1 材料與試劑

桑葉均采自國家桑種質(zhì)資源鎮(zhèn)江桑園圃中3～4月份桑樹(YU711)的2、3葉位.采摘后即刻洗凈備用.

γ-氨基丁酸購自Sigma公司(美國)；谷氨酸鈉(MSG)、十水合四硼酸鈉(Na2B4O7.10H2O)、重蒸酚、次氯酸鈉、無水乙醇，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋SY601，天津歐諾有限公司；紫外分光光度計UV-2100，尤尼柯有限公司；酶標(biāo)儀SpectraMaxi3，美國Molecular Devices公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9140A型，上海三發(fā)科技儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 GABA含量測定

參照文獻(xiàn)[10]的方法，將桑葉粉浸入100 ℃蒸餾水中(m∶V=1 ∶40)，浸泡24 h(40 ℃)，每20 min搖動一次.水浴結(jié)束后取出用4層紗布過濾，濾液再經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后即得桑葉提取液.桑葉GABA含量測定參考文獻(xiàn)[11]的方法，采用比色法測定.

1.3.2 單因素實驗設(shè)計

分別研究不同谷氨酸鈉濃度(0，3，6，9，12 g/L)，不同浸泡溫度(15，20，25，30，35 ℃)，不同浸泡時間(5，10，15，20，25 h)這3個因素對桑葉GABA富集效果的影響，每組實驗做3次平行，取平均值.

1.3.3 響應(yīng)曲面設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇最佳的浸泡濃度、浸泡溫度和浸泡時間.采用相關(guān)軟件Design-Expert.V8.0的Box-Behnken設(shè)計方法對3個單因素進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到最佳提取條件，并進(jìn)行驗證.每組實驗重復(fù) 3 次.實驗因素水平及其編碼如表1.

表1 GABA富集工藝的優(yōu)化實驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 谷氨酸鈉濃度對桑葉GABA富集的影響

控制浸泡時間為10 h，浸泡溫度為30 ℃，考察浸泡過程中谷氨酸鈉濃度為0～12 g/L時對桑葉GABA含量的影響.從圖1可以看出，隨著谷氨酸鈉濃度的增加，桑葉中GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.當(dāng)谷氨酸鈉濃度為6 g/L時，桑葉GABA含量達(dá)到最高為3.152 mg/g，之后隨著谷氨酸鈉濃度的增加，桑葉GABA的積累量逐漸降低.谷氨酸鈉作為GABA合成的前體物質(zhì)，經(jīng)谷氨酸脫羧酶生成GABA，適量的谷氨酸鈉能夠為GAD提供充足的底物促進(jìn)GABA合成，但是當(dāng)谷氨酸過度積累時，會對GABA合成通路起反饋抑制作用，降低桑葉中GABA含量.文獻(xiàn)[12]研究也得到類似的結(jié)果，谷氨酸濃度過高時，會抑制GAD活性，導(dǎo)致GABA含量降低.因此富集桑葉GABA實驗中谷氨酸鈉最佳濃度為6 g/L.

圖1 谷氨酸鈉濃度對桑葉GABA含量的影響

2.1.2 浸泡溫度對桑葉GABA富集的影響

控制谷氨酸鈉濃度為3 g/L，浸泡時間為10 h，考察浸泡溫度在15～35 ℃，浸泡時間對桑葉GABA含量的影響.

圖2 浸泡溫度對桑葉GABA含量的影響

從圖2可知，桑葉GABA含量隨著浸泡溫度的升高先增加后減少.在15～25 ℃區(qū)間內(nèi)，桑葉中GABA含量逐漸增加，達(dá)到最高點為2.84 mg/g.在一定的范圍內(nèi)，溫度的升高促使細(xì)胞Ca2+濃度增加進(jìn)而加快桑葉中GABA合成酶的反應(yīng)速率，促使GABA積累[13].但溫度過高會破壞谷氨酸脫羧酶的三級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酶活性降低，GABA含量下降[14].研究中，確定溫度25 ℃為桑葉浸泡富集GABA的最佳溫度.

2.1.3 浸泡時間對桑葉GABA富集的影響

控制谷氨酸鈉濃度為3 g/L，浸泡溫度為30 ℃，考察浸泡時間在5～25 h時對桑葉GABA含量的影響.從圖3可知，不同的浸泡時間對桑葉中GABA的積累量有顯著的差別，在5～15 h浸泡過程中，桑葉不斷吸收谷氨酸鈉，為GABA支路提供了充足的底物準(zhǔn)備，同時在浸泡過程中形成的低氧環(huán)境有利于GAD等酶的激活，因此隨著浸泡時間的延長，GABA含量逐漸上升.當(dāng)浸泡時間超過15 h后，隨著處理時間的延長桑葉中GABA含量明顯降低.可能的原因是在浸泡過程中，桑葉長期處于低氧條件，丙酮酸和乳酸等代謝產(chǎn)物不斷增加，致使溶液pH值逐漸降低，抑制GAD等酶的催化活性，降低GABA含量.因此，選擇浸泡15 h為桑葉富集GABA的適宜時間.

圖3 浸泡時間對桑葉GABA含量的影響

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果

以浸泡時間(A)、浸泡溫度(B)、谷氨酸鈉濃度(C)為自變量，以桑葉GABA含量為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析實驗，結(jié)果如表2.

表2 響應(yīng)曲面實驗方案與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計實驗的結(jié)果，得到回歸方程如下：

Y=4.24-0.34A+0.026B+0.11C+0.061AB-0.035AC+0.13BC-1.27A2-0.3 3B2-0.50C2.

由表3可知，回歸方程模型P值<0.01，表明該模型是極顯著的，因變量與自變量之間具有顯著的關(guān)系.并且失擬項是不顯著的(P>0.05)，擬合度良好，說明該模型選擇正確[15].此模型的相關(guān)系數(shù)為0.975 4，說明該模型與實驗擬合較好，可以用此模型進(jìn)行預(yù)測和分析.因此能用此模型和回歸方程確定富集桑葉GABA的最佳工藝.表3可以看出，模型中二次項均達(dá)到顯著水平，而一次項中僅有浸泡時間(A)對桑葉GABA含量影響顯著，其他一次項浸泡溫度(B)、谷氨酸鈉濃度(C)和交互項對桑葉GABA積累影響均不顯著.從各個因素的顯著性差異水平來看，各因素對桑葉GABA積累的影響依次為A(時間)>C(谷氨酸鈉濃度)>B(溫度).

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

由回歸方程得出響應(yīng)曲面和等高線，根據(jù)響應(yīng)曲面的3D圖形和等高線的形狀分析各因素對桑葉GABA含量的影響.由表3和圖4可以看出，AB和BC的交互作用對桑葉GABA含量的影響較明顯，等高線圖呈現(xiàn)密集的橢圓形，由此也說明AB和BC的之間具有一定的交互作用，這與方差分析結(jié)果相一致.此外，三因素中兩者交互作用圍成的橢圓形的等高線中心存在最小橢圓，則表明響應(yīng)值(桑葉GABA含量)在3個因子設(shè)計的范圍存在最大值[16].

表3 回歸模型與方差分析

圖4 三因素的交互作用對桑葉GABA含量影響的等高線和響應(yīng)面圖

2.2.4 桑葉GABA最佳富集工藝及結(jié)果驗證

由軟件Design-Expert 8.0.6預(yù)測桑葉GABA含量，得出最佳富集工藝條件為：浸泡時間18 h、浸泡溫度25 ℃、谷氨酸鈉濃度6.22 g/L,得到GABA含量為3.81 mg/g.為檢驗方法的可靠性，按上述優(yōu)化條件進(jìn)行桑葉GABA富集，實際測得桑葉中GABA含量為3.77 mg/g，與理論值無明顯差異.

3 討論

浸泡促使植物組織中GABA含量的增加可能有兩種原因：一方面植物在脅迫環(huán)境下，細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增加，進(jìn)而影響GAD活性[3].有研究結(jié)果表明，增加Ca2+濃度能夠刺激谷物中GAD的活性，從而促進(jìn)GABA合成[17].另一方面是浸泡處理提供了缺氧環(huán)境.植物為了抵抗不良環(huán)境脅迫，多胺物質(zhì)含量會增加，提高二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性[18].文獻(xiàn)[19]研究發(fā)現(xiàn)，鮮茶葉在缺氧條件下，腐胺和精胺含量得到顯著提升，與GAD和DAO活性的升高趨勢基本一致.實驗采用谷氨酸鈉浸泡法富集桑葉中GABA，其含量為普通桑葉的6.28倍，得到了顯著提升，這與文獻(xiàn)[4]在茶葉中富集GABA含量所達(dá)到的效果類似，但其具體累積機制尚未見文獻(xiàn)報道，有待進(jìn)一步研究.桑葉是藥食兩用植物資源，具有降血糖功能[20]，桑葉茶、桑葉粉等各種桑葉食品及原料越來越受到消費者的青睞.富集了GABA的桑葉可具有降血壓、改善睡眠等多種功能[10,21]，為桑葉食品的開發(fā)提供實驗依據(jù).

4 結(jié)論

實驗探討了不同浸泡條件對桑葉GABA積累量的影響，通過單因素和響應(yīng)曲面分析建立了浸泡法富集桑葉GABA模型，并得到最佳富集工藝，即浸泡時間18 h、浸泡溫度25 ℃、谷氨酸鈉濃度6.22 g/L，該條件下桑葉GABA含量為3.77 mg/g，為未處理桑葉中GABA含量(0.60 mg/g)的6.28倍，顯著提高了GABA含量.在浸泡過程中，浸泡時間對桑葉 GABA含量影響最大.