成人腹股溝疝囊內面病理及細菌學觀察

甘文昌，李英儒，周太成，江志鵬，侯澤輝，馬寧，陳雙

一直以來，腹股溝疝手術都被認為是無菌手術，尤其是腹腔鏡手術開展得越來越多的時候。但實際上，在行腹腔鏡腹股溝疝修補手術中發(fā)現部分疝囊壁內側面有局灶性的增厚，這些增厚常在疝環(huán)口內側疝囊頸處及疝囊頸以下水平的疝囊壁內側面，呈白色或灰白色，大小及形狀不一，而且有部分腹股溝疝疝內容物進入疝囊，與疝囊粘連緊密。這種局部增厚、粘連是否與局部細菌感染有關沒有定論。本研究試圖從中尋找證據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2015年6月至2016年12月于中山大學附屬第六醫(yī)院收治診斷為腹股溝疝病人共86例（其中男性71例，女性15例），排除18例，符合入組標準的腹股溝疝病人共68例（其中男性56例，女性12），平均年齡56±13歲。納入標準：原發(fā)腹股溝疝；擬行腹腔鏡下腹股溝疝修補術者。排除標準：復發(fā)疝；使用補片或其他材料修補，或既往有腹股溝區(qū)手術史等人為因素影響到疝囊結構者。

1.2 方法

1.2.1 宏觀觀察腹腔鏡直視下觀察所有疝囊壁內側面有無局灶性增厚（局部腹膜透明度下降、表面隆起判斷為局灶性增厚）。記錄疝種類（直疝/斜疝），增厚所在位置，增厚部位大小，形狀，顏色，有無疝內容物粘連。按疝囊內側壁有無增厚分為增厚組和光滑組。

1.2.2 顯微鏡下觀察手術分離疝囊后剪取整層疝囊組織，標本固定切片后HE染色。在光學顯微鏡下觀察兩組標本HE染色玻片，進行常規(guī)病理組織學觀察分析組織成分。

1.2.3 細菌學觀察手術分離的疝囊組織，在手術臺上剪取部分疝囊組織（增厚組取部分增厚組織，光滑組取疝環(huán)口疝囊組織），放入無菌離心管內，分別提取兩組疝囊組織中的DNA，在GenBank數據庫查找大腸桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬16SrRNA基因序列，并進行引物設計，并應用Blast軟件進行同源性匹配分析，選取特異性高的一對引物（大腸桿菌正向引物序列5′GGAGCAAACAGGATTAGATACCC 3′，反向引物序列5′AACCCAACATTTCACAACACG 3′腸球菌屬正向引物序列5′TCCACGCCGTAAACGATGAG 3′，反向引物序列5′GACACGAGCTGACGACAACC 3′，乳酸桿菌屬正向引物序列5′ACGGGAGGCAGCAG?TAGGGA 3′，反向引物序列5′AGCCGTGACTTTCT?GGTTGATT 3′，雙歧桿菌屬正向引物序列5′ACC?CTGGTAGTCCACGCCGTAA3′反向引物序列5′GG?CACAATCCGCTGGCAAC3′）。PCR反應條件設置：95℃預變性1 min，95℃變性5 s，60℃退火/延伸32 s，共40個循環(huán)。反應結束后導出實驗數據，以擴增循環(huán)次數為橫軸，熒光強度為縱軸繪制擴增曲線，循環(huán)閾值（Ct值）≥40，表明無目的DNA擴增，樣本目的基因檢測的Ct值在15~40范圍內的檢測結果可判定為陽性結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計分析由SPSS 19.0軟件完成。分類變量以率或百分比表示，分類變量頻率之間的比較使用χ2檢驗。當4×4表格中有觀察例數少于5時使用Fisher確切檢驗法。P＜0.05表示其有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 兩組病人基本資料對比

按疝囊內側面是否增厚將病人分成增厚組和光滑組，兩組病人年齡、性別、疝類型等無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 疝囊內側面增厚的概率和形態(tài)特點

2.2.1 疝囊增厚的概率疝囊增厚的概率為66.1%（37/68）。疝囊增厚與否跟性別、年齡、疝環(huán)口大小、疝類型、疝發(fā)生位置無關。病程長短、有粘連、有嵌頓史的疝囊增厚出現率更高。（表1）

表1 疝囊增厚出現率（例）

2.2.2 疝囊壁增厚部位的分布特點把內環(huán)口分成四大象限，增厚部位有，內下象限出現率56.7%（21/37），內上象限24.3%（9/37），外下象限14.0%（5/37），外上象限6.0%（2/37）。疝囊增厚有54.1%（20/37）位于疝環(huán)口周圍，僅8.1%（3/37）位于疝環(huán)口以下水平疝囊內側面，兩者皆有約為37.8%（14/37）。增厚部位的大小在0.2~5 cm之間，部分腹股溝疝可見疝內容物進入疝囊，網膜或者腸壁在疝環(huán)口附近發(fā)生粘連（n=20），增厚部分呈白色或灰白色。其余31例疝囊內側面光滑，未見局部增厚。（圖1）

圖1 疝囊壁內側面增厚部分的形態(tài)（部分示意圖）A：疝囊頸處增厚，灰白色，斑塊狀（左側腹股溝斜疝）；B：疝囊頸內側增厚，白色，斑塊狀，星芒狀（左側腹股溝斜疝）；C：疝囊頸內側不規(guī)則增厚，白色，沿疝囊頸方向走形（左側腹股溝斜疝）；C：疝囊內壁條索狀增厚，走行與疝囊頸方向垂直（左側腹股溝斜疝）

2.3 兩組疝囊組織的鏡下形態(tài)和炎性細胞計數

2.3.1 鏡下形態(tài)光滑組的疝囊組織中可見完整的單層間皮細胞，間皮細胞下纖維結締組織較薄（與疏松結締組織厚度比約1∶3），疏松結締組織中散布毛細血管，部分標本可有少許炎癥細胞（中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞）和纖維母細胞等組織成分（圖2）。

圖2 光滑組疝囊組織（HE染色）單層間皮細胞完整，纖維結締組織與疏松結締組織厚度比約1：3；組織成分：a，間皮細胞b，毛細血管c，炎性細胞d，纖維組織

增厚疝囊組織的間皮細胞也完整，但其纖維結締組織增厚（與疏松結締組織厚度比約1∶1），部分標本并見較多炎性細胞浸潤（中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞），毛細血管擴張（圖3）。

圖3 增厚組疝囊組織（HE染色）單層間皮細胞仍完整，但纖維結締組織增生，與疏松結締組織厚度比約1∶1，并且可見有大量炎性細胞浸潤；組織成分：a：間皮細胞；b：擴張的毛細血管；c：炎性細胞；d：纖維組織

2.3.2 炎性細胞計數對比增厚組共37例，其中25例（67.6%）觀察到炎性細胞浸潤，炎性細胞平均計數為53.1±1.3個，中性粒細胞15.2±2.3個，淋巴細胞35.3±1.9個，漿細胞2.6±0.6個；光滑組共31例，其中8例（25.8%）觀察到炎性細胞浸潤，炎性細胞平均計數15個，其中，中性粒細胞2.5±0.7個，淋巴細胞12.8±1.4個，漿細胞1.5±0.4個。P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

2.4 熒光定量PCR檢測結果

以大腸桿菌16SrRNA基因設計特異性引物，增厚組10例標本結果陽性2例（Ct值分別為28，28），陽性病例1為男性，58歲，左側腹股溝疝，病史23年，陽性病例2為男性，69歲，右側腹股溝疝，病史12年。光滑組1例（Ct值為29），患者為男性，66歲，右側腹股溝疝，病史6年，以腸球菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬16SrRNA基因設計特異性引物，20例標本行實時熒光定量PCR反應均無陽性檢測結果。

3 討 論

腹股溝疝是一種常見外科疾病，其研究重點常在局部解剖、術式、補片、術后并發(fā)癥等方面［1-3］。而對于疝囊的研究甚少，Tanyel等［4］在兒童腹股溝斜疝的囊壁中發(fā)現了平滑肌組織，并通過一系列的研究，提出了睪丸下降、鞘狀突閉合及先天性腹股溝疾病發(fā)病機制的新猜想［5-7］。Kais等［8］在嬰兒和兒童斜疝的部分疝囊壁內發(fā)現了環(huán)狀收縮結構，提出“疝囊環(huán)”（hernia sac ring，HSR）的概念。而對于成人腹股溝疝疝囊的形態(tài)特點，尚無系統(tǒng)的觀察研究。隨著腔鏡技術發(fā)展，我們可以更直觀地觀察疝囊的形態(tài)特點。

Jiang等［9］人在腹股溝斜疝疝囊的疝囊頸內側發(fā)現有增厚，組織病理結果提示部分增厚處存在平滑肌組織，這種增厚可能是鞘狀突融合的痕跡。這種理論可以解釋部分疝囊增厚，但是我們不僅觀察到斜疝疝囊的疝囊頸處有增厚，在直疝疝囊周圍也有增厚，并且，部分腹股溝斜疝的疝囊內壁和疝囊頸內側附近也有增厚，而且在疝環(huán)口附近可發(fā)現網膜或者腸粘連，種種跡象表明，這些增厚類似于疝囊損傷形成的瘢痕。

本研究顯示有66.1%（37/68）的腹股溝疝疝囊出現增厚，這些增厚的部位包括疝囊頸和疝囊內壁，觀察并分析疝囊增厚及粘連部分的組織病理特點，發(fā)現疝囊增厚部分纖維結締組織增生，并且在其中發(fā)現較多炎性細胞浸潤，而在光滑的疝囊中，未見到明顯炎性細胞浸潤，這些結果表明，增厚的疝囊組織有炎癥活動。

Yang等［10］人收集分析了嵌頓疝疝囊內的組織滲出液并進行分析及培養(yǎng)發(fā)現，滲出液中有大量炎性細胞滲出并且可培養(yǎng)出以大腸桿菌為主的細菌菌落。因此，致炎因子有可能來自細菌的局部感染。采用具有高度敏感性的實時熒光定量PCR方法檢測疝囊組織中的細菌，以存在于原核生物中的16SrRNA基因設計特異性引物，保證檢測的特異性，在增厚組和光滑組共20例標本中有3例得到陽性結果，即擴增出細菌DNA目的基因片段，這反映出一個問題，即部分腹股溝疝疝囊內可能有細菌存在，這些細菌可能來源于腸道內。疝發(fā)生發(fā)展過程中，疝內容物可通過擴大的疝環(huán)口進入疝囊，如果疝囊較小，嵌頓的是腸管，那么腸管首先會發(fā)生靜脈回流受阻，腸壁淤血水腫、滲出，此病理過程中，腸黏膜屏障受破壞，腸道內細菌可經局部破壞的腸黏膜進入疝囊中定植，此后，如果通過非手術手段解除了嵌頓，疝內容物回納，定植的細菌未能及時被消滅而又不引起感染，在疝囊內潛伏，對于這種情況的疝，行疝修補術并放置補片發(fā)生補片感染的風險將增加。

本研究熒光定量PCR反應結果顯示，增厚組10例標本中有2例擴增出細菌DNA片段，光滑組也有1例擴增出細菌DNA片段，對于這種情況的解釋，我們考慮，疝囊光滑到出現局灶性增厚有一個過程，但并不知曉這個過程需要多長時間，在此過程中，細菌有參與其中，即便是肉眼看見疝囊內壁光滑無粘連，也有可能已經有細菌定植，并且導致炎性改變，因此在疝囊由光滑狀態(tài)向局灶性增厚狀態(tài)轉變的過程中，可能一直有細菌參與其中，而本研究剛好捕捉到細菌存在的某個點。如果加大樣本量，增加標本中組織量，可能會有更進一步的發(fā)現。因此，腹股溝疝在發(fā)生、發(fā)展進程中，可能有細菌局部定植、感染，尤其是病程長、有嵌頓史的可能存在局部細菌感染。