結腸癌中NCAPD2蛋白過表達的臨床病理特征及預后意義

于 博，劉 穎,2，徐 然,2，白麗娜,2，馮麟媛,2，楊 洋,2

結腸癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率及病死率均較高[1-2]。近年，我國結腸癌的發病率和病死率均呈上升趨勢，且超過60%的患者在確診時已為晚期，5年生存率不足13%，預后差[3-4]。因此，臨床亟待尋找結腸癌的早期識別及預后評估的生物學標志物，以提升患者的早期診斷率，延長患者的生存期。NCAPD2從屬于染色體凝縮蛋白復合物I，是非SMC亞單位的亞基之一，主要參與染色質有絲分裂的正常分離和凝縮過程[5]。已有多項研究顯示，凝縮蛋白復合物亞基的功能異常缺失/獲得參與癌癥的發生、發展。其中，在SMC亞單位中SMC2基因的異常改變可能與胃癌和結直腸癌的發生密切相關[6]；其同屬的SMC4基因也在結直腸癌和肝癌中與細胞周期進程密切相關[7]；同樣非SMC亞單位NCAPH在結直腸癌組織中表達上調，并可作為一種預后評估標志物[8]。目前，尚無文獻報道證實NCAPD2與結腸癌患者預后之間的關系。本文采用免疫組化SP法檢測NCAPD2在結腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征、預后評估之間的關系，探討NCAPD2蛋白對結腸癌患者預后的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料組織芯片購自上海芯超生物公司，組織芯片標本180例，其中包括86例癌旁正常組織和94例結腸癌組織。94例結腸癌患者男性48例，女性46例；年齡范圍27～90歲；腫瘤直徑：≤4 cm者34例，>4 cm者60例；病理分級：Ⅰ級19例，Ⅱ級60例，Ⅲ級15例；T分期：T1+T2者11例，T3+T4者83例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期58例，Ⅲ+Ⅳ期36例；有淋巴結轉移者34例，無淋巴結轉移者60例。

1.2 主要試劑NCAPD2兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司，免疫組化SP兩步法試劑盒購于北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，行免疫組化SP兩步法染色。其中，免疫組化染色步驟參照本組前期實驗[9]，主要包括：組織切片常規烤片脫蠟水化抗原熱修復，滴加一抗4 ℃孵育過夜后滴加二抗孵育45 min，DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。選擇NCAPD2蛋白強陽性染色的切片作為陽性對照，選擇以PBS代替一抗的染色結果作為陰性對照。

1.4 評定標準根據Beesley分級法，以細胞質和細胞核中出現棕褐色顆粒的比例作為判定NCAPD2蛋白陽性染色的標準。根據陽性細胞百分比計分：陽性細胞數占0～5%為(-)，6%～25%為(+)，26%～50%為()，51%～75%為()。其中“+～”為陽性，“”為強陽性。

1.5 生信分析采用TIMER數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)檢索NCAPD2基因在多種腫瘤中的差異表達；應用UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析結腸癌組織和正常黏膜組織中NCAPD2 mRNA的表達及其與臨床病理特征的關系；應用GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)分析在正常結腸黏膜組織、結腸癌組織和轉移性結腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達水平。

1.6 統計學分析應用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法分析NCAPD2表達與臨床病理特征的相關性；采用t檢驗分析NCAPD2 mRNA表達與腫瘤分期和淋巴結轉移之間的關系；采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗進行生存分析；Cox回歸模型進行單因素和多因素預后分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達通過TIMER數據庫檢索發現，NCAPD2基因在多種惡性腫瘤組織中表達上調，其在結腸癌組織中mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01，圖1A)；GEO和UALCAN數據庫分析顯示，與癌旁正常組織相比，結腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達水平顯著上調(P<0.01，圖1B、C)。進一步分析NCAPD2 mRNA的表達水平與臨床病理特征的關系，發現其與結腸癌臨床分期和淋巴結轉移密切相關(P<0.05)：在不同分期的結腸癌組織中NCAPD2的表達水平均顯著高于癌旁正常組織(圖2A)；且結腸癌無淋巴結轉移(N0)和有淋巴結轉移(N1～N2)組織中NCAPD2 mRNA表達水平均高于癌旁正常組織(P<0.05，圖2B)。此外，GEO數據庫分析顯示，與結腸癌組織相比，NCAPD2 mRNA在轉移性結腸癌組織中的表達水平亦顯著升高(P<0.01，圖2C);提示NCAPD2與結腸癌的惡性演進密切相關。

圖1 NCAPD2 mRNA在結腸癌組織中的表達：TIMER(A)數據庫分析各種腫瘤組織中NCAPD2 mRNA表達；GEO(B)和UALCAN(C)數據庫分析不同結腸組織中NCAPD2 mRNA的表達

圖2 NCAPD2 mRNA在不同結腸癌組織中的表達差異：UALCAN數據庫中NCAPD2 mRNA表達水平與結腸癌臨床分期(A)和淋巴結轉移(B)的關系；C.GEO數據庫原發及轉移性結腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達

2.2 結腸癌組織中NCAPD2蛋白表達免疫組化結果顯示，NCAPD2蛋白在結腸良性病變組織中呈陰性，在結腸癌組織中呈陽性，且主要表達于細胞質和細胞核(圖3)。在結腸癌組織中，NCAPD2蛋白陽性率和強陽性率分別為89.36%(84/94)和75.53%(71/94)；在癌旁正常結腸組織中NCAPD2蛋白陽性率和強陽性率分別為34.88%(30/86)和19.77%(17/86)。在結腸癌組織中NCAPD2蛋白陽性率和強陽性率均顯著高于癌旁正常結腸組織，差異有顯著性(P<0.01)，提示NCAPD2蛋白在結腸癌組織中表達上調。

圖3 NCAPD2蛋白在癌旁正常結腸組織中呈陰性(A)，在結腸癌組織中呈弱陽性(B)、陽性(C)、強陽性(D)，SP兩步法

2.3 NCAPD2蛋白過表達與結腸癌臨床病理特征的關系進一步對NCAPD2蛋白過表達與結腸癌臨床病理特征的關系進行分析發現，NCAPD2蛋白表達水平與結腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度及T分期無關，與臨床分期和淋巴結轉移有關(P均<0.05，表1)。其中，NCAPD2蛋白在結腸癌晚期(Ⅲ+Ⅳ)組織中的強陽性率(88.9%，32/36)明顯高于早期(Ⅰ+Ⅱ)組織(67.2%，39/58，P=0.004，圖4A)；在有淋巴結轉移的結腸癌組織中的強陽性率(88.2%，30/34)明顯高于無淋巴結轉移組織(68.3%，41/60，P=0.031，圖4B)。

表1 結腸癌組織中NCAPD2蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

圖4 NCAPD2蛋白表達與結腸癌臨床病理特征的關系：

2.4 生存分析Kaplan-Meier生存分析顯示，NCAPD2蛋白高表達的結腸癌患者總生存期明顯低于NCAPD2蛋白低表達患者(Log-rank=5.602，P=0.018，圖5A)；且NCAPD2蛋白高表達的T3+T4分期結腸癌患者總生存期亦明顯低于NCAPD2蛋白低表達患者(Log-rank=7.803，P=0.005，圖5B)。Cox單因素分析結果顯示，NCAPD2表達、臨床分期和淋巴結轉移均是影響結腸癌患者生存期的風險因素(P均<0.05，圖6A)。Cox多因素分析顯示，NCAPD2表達與臨床分期均是影響患者結腸癌生存期的獨立風險因素(P<0.05，圖6B)；提示NCAPD2蛋白可作為結腸癌患者不良預后的獨立風險因素。

圖5 NCAPD2蛋白表達與結腸癌患者預后的相關性：

圖6 Cox分析影響結腸癌患者預后的因素：

3 討論

結腸癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，早期結腸癌患者的生存率高達90%，但早期診斷存在局限性，致使結腸癌患者早期診斷率不足40%[10]。

近年隨著對結腸癌分子生物學特性及發病機制的深入分析，已有生物學標志物用于結腸癌的早期診斷及預后監測，如CEA、CA19-9和CA12-5等，但在癌前病變和臨床早期中的診斷敏感性和特異性低[11]。羅志飛等[12]研究結果顯示，不同基因的異常表達可通過影響細胞周期的紊亂促進結腸癌的演進。朱劍軍等[13]在結腸癌中的研究發現，細胞周期的紊亂可以促進腫瘤細胞的惡性增殖。因此，從分子生物學水平闡明結腸癌的分子機制，尋找潛在的分子標志物具有非常重要的臨床意義。

染色體凝縮蛋白復合物是一種多蛋白復合物，其包含凝縮蛋白復合物Ⅰ和Ⅱ，前者主要定位于細胞質，后者則定位于細胞核。其中，凝縮蛋白復合物Ⅰ由SMC亞單位和非SMC亞單位組成，SMC亞單位包括SMC2和SMC4，非SMC亞單位包括NCAPH、NCAPD2、NCAPG三種亞基。有研究顯示，染色體凝縮蛋白復合物Ⅰ的亞基之一的NCAPD2的缺失可縮短有絲分裂前中期染色體的長度，延長細胞分裂的前中期及后期[14-15]。此外，NCAPD2上的HEAT重復組成的一個串聯排列的雙螺旋結構，可在蛋白質之間的相互作用中發揮重要的調控作用[16]。同時，其作為細胞周期調控因子酪蛋白激酶2的作用靶點，與細胞退化、DNA損傷位點識別等生物學功能密切相關[16-17]。雖然科研界對于NCAPD2的生物學功能有所了解，但對于NCAPD2與人類疾病，尤其是腫瘤間的相關報道較少。近年研究結果證實，NCAPD2基因多態性參與中國漢族人帕金森的發病過程[18]；NCAPD2在神經母細胞瘤中表達上調，并預示患者的不良預后[19]。Zhang等[20]研究結果亦證實了凝縮素蛋白復合物的表達水平可促進腫瘤細胞的增殖，并且可作為肝癌患者不良預后的獨立風險因素。但尚無研究明確NCAPD2表達與結腸癌之間的關系。

本實驗發現，NCAPD2 mRNA表達水平在結腸癌組織中顯著升高，其表達與臨床分期、淋巴結轉移關系密切(P<0.05)。免疫組化結果與之一致，NCAPD2蛋白在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)；提示NCAPD2與結直腸癌的發生、發展存在一定的相關性。進一步相關性分析發現，NCAPD2蛋白高表達與結腸癌臨床分期(P=0.001)、淋巴結轉移(P=0.047)呈顯著正相關；揭示NCAPD2作為癌基因在結腸癌的惡性演進中發揮重要作用。此外，Kaplan-Meier生存曲線分析、Cox回歸模型顯示，NCAPD2蛋白高表達的結腸癌患者的生存期顯著低于NCAPD2蛋白低表達患者，且NCAPD2蛋白表達水平是結腸癌患者獨立的預后不良因素；提示NCAPD2蛋白是判斷結腸癌不良預后的潛在分子標志物。

綜上所述，NCAPD2在結腸癌組織中的表達存在不同程度的升高，其高表達狀態可預示結腸癌較強的惡性程度、轉移潛能和不良預后，對結腸癌患者的早期診斷和預后評估具有一定的臨床指導意義。