網絡藥理學在中藥復雜作用模式研究中的應用進展

韓利文，陳善軍，董榕，張友剛，王曉靜

(山東第一醫科大學(山東省醫學科學院) 藥學與制藥科學學院，山東 濟南 250017)

傳統中藥是我們國家延續千年的瑰寶，尤其是在全球防治新冠疫情過程中發揮了舉世矚目的作用[1- 2]。傳統中藥治療疾病強調“整體觀”與“辨證論治”，與源于西方的現代醫學的理論體系和技術手段均有顯著不同。中藥本質是由多成分組成的復雜系統，人體也是一個更為復雜的生命系統，當中藥進入人體后，與機體發生的相互作用是一個龐大的系統-系統的相互作用。因此，闡述中藥復雜組分與多重功效之間的交互規律、科學表征中藥復雜作用模式是中藥現代研究亟需解決的關鍵問題。

近十年來，隨著系統生物學、人工智能、多向藥理學等技術的快速發展，網絡藥理學(network pharmacology)應運而生[3- 4]。網絡藥理學是運用多種組學技術、網絡分析技術構建并揭示藥物-成分-靶點-疾病之間的關系，闡述藥物作用機制、探索藥物與疾病之間相關性的一門前沿學科。網絡藥理學聚焦系統層次和生物網絡之間的關聯關系，與傳統中藥的作用模式不謀而合[5-7]。本文綜述了網絡藥理學技術近年來在中藥復雜作用模式表征方面的研究新進展，為傳統中藥科學內涵的現代闡釋提供參考。

1 中藥復雜作用模式研究的現狀

目前已知中藥的作用模式特征為多環節、多靶點的整合調節。經過國內外科學家不斷地努力探索，中藥復雜體系作用模式的解析已經獲得巨大進步。在基于整體觀和系統論的指導思想下，形成了如強調藥動-藥效關聯的化學指紋-藥代標志物-藥效靶標三維中藥復方研究新模式[8]、以內源性代謝物為核心的中醫方證代謝組學[9-10]、基于成分鉤釣的中藥化學生物學[11- 12]等新理論和新技術。但是，中藥復雜作用模式的解析與表征依然存在不少問題：中藥成分是直接作用于靶點，還是改變了機體內環境？多成分之間是如何協同作用的？外源性成分與機體內源性成分之間是如何進行信息交互的？因此，中藥復雜體系作用模式的研究依然任重道遠，需要引入新的技術手段和研究理念。

2 網絡藥理學研究的基本思路

網絡藥理學主要是通過系統生物學的研究方法，借助統計學、復雜網絡等數學手段，能夠在分子水平上更好地詮釋中藥多成分與機體的網絡作用關系的一門科學。網絡藥理學的核心是網絡，用網絡科學的方法研究中藥的多向藥理特性，用網絡拓撲性質來反映中藥藥效成分的理化和生物學性質，為探索中藥復雜作用模式提供了新的視角。

利用網絡藥理學研究中藥復雜作用模式的研究思路是構建中藥復雜化學成分庫，將中藥成分的潛在分子靶標和疾病相關靶標共同映射于生物分子網絡，以生物分子網絡為基礎建立中藥藥效成分與疾病的關聯機制，從而解析中藥的復雜作用模式(圖1)。

圖1 利用中藥網絡藥理學研究中藥作用模式的基本思路Fig.1 Basic research flow for using network pharmacology to study the mechanisms of action of traditional Chinese medicine

3 網絡藥理學的研究內容

3.1 中藥化學成分的整合與收集

中藥成分是網絡藥理學分析的起點，納入的中藥成分的范圍和準確度直接影響到后續分析的正確性。

(1)直接利用已有數據庫進行成分收集。常用的中藥化合信息數據庫有中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、整合藥理學平臺TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)、基于中藥分子機理的生物信息學分析工具BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)、中醫藥綜合數據庫TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid)、PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)等。2020年新冠疫情期間，韓利文等[13]發現國家衛健委推薦的參麥注射液對于COVID-19 合并冠心病患者具有較好療效，考慮到注射劑直接入血的特點，利用 TCMSP和中醫藥百科全書(ETCM)收集了紅參、麥冬的全部化學成分，從抑制細胞因子風暴、維持心臟功能穩態、調節免疫、抗病毒等多方面揭示了參麥注射液能夠同時干預COVID-19與冠心病的機制。

(2)基于高分辨質譜解析的中藥成分分析與鑒定。中藥成分數據庫是基于文獻構建的，往往有滯后性。因此中藥成分的組學表征甚至全成分分析[14]逐漸成為了“建庫成分”的關鍵補充手段。Luo等[15]利用超高液相色譜-電噴霧線性離子阱軌道阱質譜(UHPLC-LTQ-ESI-Orbitrap-MS)技術建立了厚樸溫中湯的指紋圖譜，確認并鑒定了其中甘草苷、橙皮素等30個共有成分作為后續分析的關鍵成分。Shi等[16]建立了基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜(UPLC-Q-TOF-MS/MS)的代謝組學技術，分析了中藥梔子614種成分，并鑒定與抗血栓活性相關的化學標志物19個。

(3)基于體內過程的中藥藥效成分識別。中藥的特定方劑組合之間的相互作用，會在一定程度上影響成分的入血吸收。通過實驗方法檢測能夠入血并且在體循環中移行的中藥成分，是判斷中藥藥效物質的一種有效方法。付昌麗等[17]將良附滴丸給大鼠灌胃后，應用超高液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜技術檢測到血漿中移行成分為高良姜素、鼠李檸檬素、高良姜素-3-O-甲醚、α-香附酮，據此使用網絡藥理學方法分析了良附滴丸治療胃腸道疾病的可能機制。王偉等[18]結合血清藥物化學與網絡藥理學探究麝香通心滴丸治療冠心病的機制，認為8 種入血成分(沙蟾毒精、牛磺膽酸、遠華蟾毒精、甘氨膽酸、去乙酰華蟾毒精、蟾毒靈、熊去氧膽酸、脂蟾毒配基)可能是麝香通心滴丸發揮治療冠心病作用的關鍵藥效成分。中藥藥效成分的研究是一個不斷完善的過程，通過檢索或實驗等方法，及時將國內外的新發現、新成果納入，才能逐步建立起比較真實反映藥材內在特征的“成分庫”。

3.2 中藥-成分-疾病-靶點網絡模型的構建

藥物與疾病的關聯關系的識別，是網絡藥理學研究的基礎。常用的數據庫有TCMSP、TCMIP、化合物與蛋白互作數據庫STITCH(http://stitch.embl.de/)、PharmMapper(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper)等。除此之外還有反向分子對接技術以及分子對接法[19]。疾病靶點數據庫常用的有在線人類孟德爾遺傳數據庫OMIM(https://www.omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、療效藥靶數據庫TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)等。其中Drugbank是針對已上市藥物進行檢索的數據庫。

網絡構建是通過數學領域圖論和復雜網絡的方法，將藥物、疾病、靶點描述成節點，藥物與靶點、疾病與靶點之間的關系描述成邊。節點與邊構成多個體、多層次的復雜網絡。網絡構建中常用的算法有Randomwalk 算法和PRINCE算法。Randomwalk算法是從一個節點出發，然后隨機計算該節點與其他相鄰節點的相關性，進而建立藥物-靶點-疾病網絡，本質是一種網絡聚類算法[20]。而PRINCE算法是假設引起相似疾病的基因或蛋白在網絡中位置相近，因此可使用基于傳播的算法來推斷在網絡上相鄰節點的關聯性，以獲得相同疾病或相似疾病的致病基因信息[21]。

3.3 網絡可視化呈現

生物網絡結構復雜，節點眾多，并且節點之間的作用強度不一，為了篩選網絡中的重要節點與通路，必須進行網絡的可視化。能夠進行可視化的軟件有Cytoscape、TDAview、VisANT、GUESS等[22]。其中Cytoscape[23]是最為常用的可視化軟件，集成了布局設計、網絡查詢、網絡可視化、網絡鏈接等功能。Cytoscape還可方便安裝多種插件，如Bisogent(用于網絡構建和可視化)、CytoNCA(用于蛋白質相互作用網絡中心性分析和評估)、ClueGO(用于基因注釋)、clusterMaker2(實現眾多聚類算法)等。

3.4 網絡分析

網絡分析本質是網絡拓撲結構的分析。基因本體( gene ontology， GO)富集分析提供了一種描述基因產物之間相似性的方法，可以對網絡中的節點基因或蛋白進行分子功能(molecular function，MF)、細胞組件(cellular component，CC)及生物過程(biological process，BP)的注釋。GO 富集分析主要通過序列相似性比對(BLAST)和結構域相似性比對(InterProScan)的方式實現，同時更多的具有動態特征的蛋白質相互作用的算法也被開發出來[24]。通路富集分析是將基因或蛋白富集到已知功能的生物學通路的過程，用以預測基因或蛋白可能參與的生物學通路，建立與疾病的內在聯系。大多數通路富集分析都是基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)進行的。常見的一些開源整合的工具如DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov)，STRING數據庫(https://www.string-db.org/)、Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)及北京大學開發的Kobas數據庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)均可以方便地實現GO注釋及KEGG通路富集分析的功能。

4 網絡藥理學在中藥作用模式研究中的應用

4.1 基于網絡靶標的中藥復雜作用模式的表征

網絡靶標的提出為中藥作用模式的研究提出了新的視角。常規的以單靶標為特點的還原論研究模式對于中藥復雜作用的解釋具有理論缺陷，網絡靶標理念契合了中醫藥學的整體論思想，已成為了網絡藥理學的核心理論之一。網絡靶標是指生物網絡中，能夠機制性關聯藥物和疾病，并定量表示藥物整體調節作用機理的網絡關鍵環節，包括關鍵分子、關鍵通路或關鍵模塊等。Chamberlin等[25]對40 000個以上天然來源小分子成分與美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的癌癥藥物進行了網絡靶標差異分析，發現天然小分子網絡靶標的覆蓋度高于后者61%，還覆蓋到目前癌癥藥物沒有作用的24條信號通路，提示部分天然小分子可能成為新的抗癌藥物。Sun等[26]對銀杏葉等18種抗阿爾茨海默病中藥進行了網絡靶標分析，結果顯示部分中藥成分不僅對乙酰膽堿酯酶等已知靶標有作用，同時還對維持細胞增殖和炎癥上游Ga2+平衡通路具有密集靶向性，顯示了中藥的整體調節作用。吳丹等[27]對臨床抗抑郁方劑中的主要藥味柴胡進行網絡藥理學分析，采用 DAVID 及DisGeNET 等數據庫對柴胡靶點進行歸屬，結果表明柴胡中有效成分可作用于50個靶標，形成多成分-多靶點-多途徑抗抑郁作用模式。

清華大學Guo等[28]首次構建了一種基于網絡的全基因組致病基因預測方法“CIPHER”，對消化系統的不同部位(胃、腸和肝)、不同階段(正常人、炎癥和癌癥患者)的基因表達譜數據進行炎-癌相關分析，篩選出了消化系統炎-癌轉化的候選靶標，構建了炎-癌轉化關鍵分子網絡。網絡靶標的提出也為中藥非線性、開放性復雜體系作用模式研究提供了新的思路[29]。

4.2 網絡藥理學在揭示中醫“同病異治”原理方面的應用

“同病異治”是指病癥相同，但由于疾病進程、具體證型、患者的身體機能等的不同而具體的治療方法也有所不同。同病異治的理念充分體現了中醫辨證施治的特色，從生物網絡調節的角度揭示了不同方劑、不同成分作用于機體產生的共性特征。在新型冠狀病毒肺炎診療方案中，熱毒寧、血必凈注射液均可用于重型和危重型患者的治療，二者藥味組成差異較大，但都對COVID-19有確切療效。蔡孟成等[30]采用網絡藥理學的方法，發現熱毒寧與血必凈兩方可共同作用于VEGF-A、CASP3、IL-6、MAPK1、MAPK8等51個靶標，推測這些共有靶標與關鍵通路構成了兩方“同病”的原因。

參芪地黃湯和加味真武湯兩方均可用于治療糖尿病腎病，但其適用的證型不同，前者適用于“氣陰兩虛型”，后者適用于“脾腎陽虛型”。王小雨等[31]利用中藥整合藥理學計算平臺 TCMIP構建參芪地黃湯和加味真武湯的候選靶標與糖尿病腎病相關疾病靶標之間的共同映射模型，發現參芪地黃湯和加味真武湯均可以作用于AKT1、INS、TLR4、VEGFA等關鍵靶標，通過調節氧化應激、炎癥反應、血液流變學異常等網絡作用途徑發揮保護腎功能、延緩糖尿病腎病進程的藥效作用。

4.3 網絡藥理學在揭示中醫“異病同治”機制方面的應用

異病同治指不同的疾病在發展過程中出現了相同的病機，而采用相同中藥治療的用法。中藥的多靶標作用模式，不僅可以解釋中藥對某一疾病的多角度干預作用，而且還有可能“覆蓋”到其他相關疾病。抑郁癥、乳腺增生和功能性消化不良是臨床常見疾病，這三種疾病共性的中醫證候為肝郁脾虛證。經典名方逍遙散在臨床中對于中樞神經系統(如抑郁癥)、消化系統(如功能性消化不良)、婦科(如乳腺增生)、內科等疾病上均有確切的療效，但其科學機制并不清楚。衛拂曉等[32]發現逍遙散與三種疾病共享了IL-6、IL-4和TNF等38個靶標，推測可能是逍遙散通過減少炎癥反應發揮了異病同治作用。葉雪珂等[33]對于酸棗仁湯的網絡藥理學分析結果顯示，酸棗仁湯干預失眠和抑郁癥可能是通過刺激HTR1A、HTR2A、DRD2、CYP2D6、GABRA1、GABRB2等6個關鍵靶標，以達到對腦內神經遞質的調節，實現鎮靜安神和抗抑郁的功效。

經典名方桃紅四物湯是中醫臨床使用最廣泛的活血化瘀方劑之一，也是異病同治的典型方劑。鄧晶晶等[34]以桃紅四物湯養血、活血、逐瘀功效為核心，采用網絡藥理學方法，構建了桃紅四物湯成分-靶標-通路-疾病之間的關聯，發現桃紅四物湯共涉及血液循環系統調節、內分泌調節等165條通路，可關聯的疾病為癌癥相關疾病(乳腺癌、前列腺癌等)、心血管疾病(高血壓、心肌梗死、心臟衰竭)以及神經系統疾病，為臨床科學使用提供了一定依據。

4.4 網絡藥理學在中醫癥候解析研究中的應用

證候是中醫藥理論的核心，是中醫臨床認知疾病、診療疾病的基礎。證候的分子生物學本質是當前中藥現代研究的重點和難點。網絡藥理學技術能夠建立起宏觀病證表型與微觀生物分子之間的網絡關聯關系，為揭示證候本質提供了新的解決方案。按照中醫藥理論，COVID-19 肺炎初期為寒濕郁肺證、重癥期為疫毒閉肺證、危重期為內閉外脫證、恢復期為肺脾氣虛證。許海玉等[35]以癥狀為切入點，首次利用網絡藥理學方法闡釋了中藥干預 COVID-19 過程中“四個時期-四個證候-四個方劑”的分子生物學基礎研究，為傳統中醫藥用于抗擊全球疫情蔓延提供了科學依據。牛旭艷等[36]綜合運用定向文本挖掘、基因芯片技術以及網絡構建的方法，首次發現中藥治療熱證類風濕性關節炎“藥-證”對應的分子生物學機制與GM-CSF信號通路，CTLA4 信號通路，T 細胞受體信號通路及輔助 T 細胞中的 CD28 信號通路有關。

4.5 網絡藥理學技術在中藥靶標預測中的應用

中藥的“多靶標”的表征對于揭示中藥科學內涵以及研發新藥都是至關重要的。常規的靶標預測的方法是利用生物化學的方法，即利用一個小分子作為探針觀察與生物大分子的特異性結合或蛋白表達，以判斷藥物的作用位點。這樣的策略比較精準，但是對于中藥這樣一個多成分體系而言，每增加一個成分意味著工作量的成倍增加，同時很難實現群體成分的整體標記[37]。網絡藥理學可借助計算機輔助算法實現藥物的多靶預測，對于中藥復雜成分的作用模式研究提供了巨大的便利。Liao等[38]運用drugCIPHE技術預測了丹參素冰片酯的潛在靶標，發現丹參素冰片酯對VEGF信號通路、Rap1信號通路、細胞緊密連接具有特異性親和作用，并進一步使用HUVEC細胞模型、斑馬魚模型驗證了其作用機制，為新藥成分的作用途徑研究提供了新的思路。李翔等[39]通過對復方丹參方的網絡藥理學分析，發現其中丹參酮 IIA等9個活性成分可調控PPARG、ACE、KCNJ11、KCNQ1、ABCC8等42個心血管相關疾病基因表達，涉及糖尿病、高胰島素型低血糖癥等 30 種疾病，為復方丹參方探索新的臨床適應癥提供了理論依據。Gao等[40]利用網絡藥理學技術分析了中藥延長晚期肝癌患者生存時間的潛在機制，發現有8種中藥能夠顯著調節多個與肝癌相關的靶標，其中與肝癌細胞增殖相關的有KRAS、AKT2，與轉移相關的有MAPK、SRC、MMP，與腫瘤血管生成有關的有PTGS2，與誘導凋亡相關的有CASP3。高耀等[41]利用網絡藥理學反向藥效團匹配方法(PharmMapper)預測逍遙散活性成分的潛在靶點, 借助 MAS生物分子功能軟件對靶點信息進行注釋, 結果發現逍遙散中活性成分可作用于glutathione S-transferase P等25個潛在靶點蛋白群。

4.6 網絡藥理學在中藥配伍原理方面的應用

“七情和合”是中藥配伍的理論指導，配伍可以改善藥物性能，在體外、體內、病理狀態等多層次因素作用下，發揮“增效減毒”的目的。在微觀的分子層次，體現為不同中藥與生物分子網絡存在交互作用，為此李梢教授提出“共模塊”概念[42]，為中藥復方配伍機制的分子網絡解析奠定了理論基礎。

韓彥琪等[43]對元胡止痛滴丸中28個入血成分進行網絡藥理學分析，結果表明，君藥延胡索中的生物堿類成分可通過作用于中樞腦啡肽酶、平滑肌相關受體及血管緊張素等靶點而發揮止痛、理氣等功效；臣藥白芷中的香豆素類成分可通過參與痙攣、炎癥等相關信號通路的調節，發揮行氣血的輔助作用，初步揭示了元胡止痛滴丸治療原發性痛經的配伍機制。合歡皮為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥樹皮，具有解郁安神的功效，臨床數據顯示具有潛在的腎毒性。梁雨璐等[44]分析了合歡皮活性成分-焦慮癥以及活性成分-腎毒性共有靶點蛋白互作模式，發現合歡皮中硫黃菊素、木犀草素等木脂素及黃酮類化合物可能通過影響神經遞質 5-HT 以及下丘腦-垂體-腎上腺軸、下丘腦-垂體-性腺軸、下丘腦-垂體-甲狀腺軸發揮作用；而合歡皂苷類成分可誘導炎癥反應、缺氧狀態、異常凋亡、氧化應激反應和自噬失衡產生腎毒性。莊開顏等[45]比較了甘草4種成分(甘草酸、甘草素、甘草苷、異甘草素)對烏頭堿所致斑馬魚模型心動過速及心包水腫的拮抗作用，發現4 種成分均具有一定的拮抗作用，其中甘草酸效果最好；網絡藥理學分析的結果顯示甘草酸拮抗烏頭堿心臟毒性的作用機制可能與MAPK、GRB2、CDC42、EGFR、GSK3B、SRC等關鍵靶點以及PI3K-Akt、Ras、FoxO等信號通路相關，初步揭示了“附子-甘草”配伍減毒的原理。

5 網絡藥理學目前存在的問題

5.1 中藥成分數據庫的更新問題

雖然網絡藥理學突破了傳統的單成分、單靶點的研究模式，但對于數據庫的依賴還是比較嚴重的，尤其是中藥成分數據庫的更新程度嚴重影響著下游網絡藥理學分析結果的可靠性[46]。中藥中發現的特征成分、新的活性成分如不能及時納入成分庫中，那么分析的依據就只能是常見成分、植物中共有的成分。大量的中藥網絡藥理學分析最后往往將關鍵成分指向谷甾醇、槲皮素等，就反映出了相當嚴重的問題。另外從數據的篩選過程來看，以數據庫自帶的參數篩選，如口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、類藥性(drug likeness，DL)等，即便是相同的篩選策略，不同的數據庫納入分析的成分也有所差別[47]。

5.2 數學建模與生物真實系統的差異

網絡藥理學借助數學方法將中藥復方在生物體內各系統中的相互作用關系以網絡的形式抽象表達出來，通過網絡節點的性質(連接度、權威性等)、節點之間的距離、網絡中存在的“社區”等因素來構建關系網絡，用網絡拓撲性質來反應藥物理化和生物學性質。但是網絡藥理學畢竟是一種體外預測技術，很難真實反應體內的復雜環境，其相互作用關系仍需大量的體內外實驗進一步驗證[48]。

5.3 中藥特色的量效關系難以體現

中醫藥學是“個性化”精準用藥的典型代表，擁有完善的“辨證施治”“君臣佐使”理論體系。同樣的藥味在不同的病癥、不同的病程、不同的配伍環境中的差異在中醫臨床是普遍存在的。但是網絡藥理學目前僅能呈現一種化學節點與生物節點之間的作用關系，不能提供額外的“量效”關系，因此目前無法體現藥味劑量導致的方劑功效的差異，最終影響到網絡分析的準確性。例如對于相同藥味組成的方劑，如左金丸與反左金丸，如果輸入二者化學成分，會導出同樣的分析結果。

6 展望

針對目前網絡藥理學存在的問題，國內外專家學者在積極地反思和采取一系列的舉措。(1)建立正確使用網絡藥理學的技術規范。2021年3月李梢教授牽頭起草、世界中醫藥聯合會公布的《網絡藥理學評價方法指南》(下稱《指南》)[49]，是國際上首個專門用于網絡藥理學評價的標準。該《指南》的頒布，為網絡藥理學的使用規范性以及可驗證性等方面提出了明確的評價標準，為網絡藥理學研究的良性發展提供了重要依據。(2)更加重視網絡核心算法的開發。網絡分析算法及軟件是網絡藥理學技術的核心，算法的開發需要充分結合復雜生命機體的信息交互方式。同時算法的開發均需經過嚴謹、規范的評價流程。(3)網絡藥理學需加強與新興信息科學如人工智能(AI)技術的融合。通過深度學習、機器學習和圖像識別等技術，AI已經成為藥物研發中最熱門的領域，同時也給網絡藥理學的完善帶來了新的機遇。一些新發展的深度神經網絡模型如PhosIND[50]，可通過提取、結合序列和蛋白質-蛋白質相互作用信息來預測磷酸化位點，應用于網絡藥理分析中，可大大提高預測性能和精準度。(4)加強與臨床數據的整合。中醫藥是整體科學，目前各種組學、大數據技術已經深入應用到中醫藥臨床實踐中。網絡藥理學應充分整合中醫藥臨床使用相關數據，反映出中醫臨床用藥特點，才能真實、準確地刻畫出中藥-疾病的關系網絡。

總之，網絡藥理學目前發展迅速，在傳統中醫藥現代研究中已經顯示了巨大的潛力，但仍需加強與多學科的深入交叉融合，借鑒生命科學、生物化學、結構生物學等領域發展的最新成果，才能全面真實地揭示中藥復雜作用模式的科學內涵，服務于中藥的現代化研究。