多指標權重-響應面法優化葆腎1 號配制工藝研究

賈立波，卞振華（通訊作者）

（南京中醫藥大學無錫附屬醫院藥學部 江蘇 無錫 214071）

葆腎1 號方為我院腎內科臨床實踐經驗方，在繼承前輩江蘇省名中醫徐南甲、藍華生主任在“脾虛”、“濕熱傷腎”理論的基礎上，提出了“腎絡不固”是早中期慢性腎炎的基本病理機制，以益腎固絡法治療慢性腎炎，葆腎方是以益腎固絡法治療早中期慢性腎炎的基本方[1]，具有益腎和絡、扶正祛邪、脾腎兼顧之功?；诒痉皆诙嗄甑呐R床使用中具有較好的療效，未見不良反應，擬研發為院內制劑。本試驗以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸的轉移率和浸膏得率作為綜合評價指標，采用響應面法優選葆腎1 號的提取工藝，為該制劑的研發奠定基礎。

1.儀器與材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），DAD 二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；BSA224SCW 電子天平（德國Sartorius 公司）。毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸對照品（批號：111920-201606，110753-201817），均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific公司），其他試劑均為分析純。實驗所用飲片均購自蘇州天靈中藥飲片有限公司。

2.方法

2.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱：XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.2%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0 ～10 min，92%A；10 ～12 min，92%A →89%A；12 ～50 min，89%A；50 ～65 min，89%→80%A；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。采用波長切換法：0 ～26 min，326 nm，測定綠原酸；26 ～65 min，254 nm，測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷[3]。

2.1.2 溶液的制備 對照品溶液的制備：稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇定容，配制成相應的對照品溶液濃度為32 μg·mL-1、53 μg·mL-1。供試品溶液的制備：精密吸取1.5 mL 葆腎1 號樣品，置于5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲（300 W，40 kHz）10 min，靜置放冷后加甲醇至刻度，混勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。陰性樣品溶液的制備：分別稱取缺黃芪、缺石韋的全方飲片，照上述供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.2 提取工藝試驗

2.2.1 Box-Behnken 響應面法試驗設計[4]

按處方量稱取全方飲片，共72.5 g，分別取17 份。運用Box-Behnken 設計模型，選取三個因素三個水平試驗：A（煎煮時間：1、1.5、2 h）、B（煎煮次數：1、2、3 次）、C（加水量：8、10、12 倍）。按照設計方案，全方飲片浸泡30 min，煎煮后趁熱過濾，合并濾液，濃縮至200 mL。

2.2.2 浸膏得率測定 將樣品分別吸取25 mL 樣品至已恒重的蒸發皿中，水浴加熱至干，105 ℃干燥5 h，冷卻30 min 后稱重，105 ℃再干燥2 h，冷卻后稱重，直至恒重。

2.2.3 樣品成分含量及轉移率測定 分別精密吸取濃縮后的樣品溶液1.5 mL，照“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液，照“2.1.1”項下的色譜條件，記錄峰面積，計算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸含量，并計算響應面試驗中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和綠原酸的轉移率。

3.統計學分析

所得數據用Design-Expert8.0.6 軟件進行的統計分析，P＜0.05 表示數據有統計學差異。

4.結果

4.1 響應面法分析和結果

為將所有指標綜合為一個能反映總體效果的值，試驗中引入多指標權重來考察提取工藝[5]，兼顧君臣藥的主要貢獻度、有效成分的可測性以及中藥多成分發揮藥效的特點，賦予各指標不同權重，賦予毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率、綠原酸轉移率、浸膏得率分別為50%、30%、20%權重，見表1。

表1 試驗方案與結果

上述實驗所得數據用Design-Expert8.0.6軟件進行響應面分析。以綜合評分為響應值Y 分別對各因素X（自變量）進行多元線性回歸方程擬合，回歸方程Y = 83.50 ～0.20A+12.53B+3.01C-1.42AB-0.18AC-2.20BC+0.21A2-12.52B2+0.74C2。R2= 0.8730，adjR2= 0.7097。方差分析可知，模型的F= 5.35，P= 0.0190 ＜0.05，表明實驗所采用的二次模型有統計學意義；失擬項P= 0.4377 ＞0.05，說明模型選擇合適，因此可用該回歸方程作為試驗真實點對實驗結果進行分析。由P值可知，因素B 提取次數的P= 0.0009 ＜0.01，說明提取次數對提取率有極顯著影響，提取時間（P= 0.9332）和加水量（P= 0.2295）對提取率無顯著影響（P＞0.05）。以綜合評分結果最大值為目標，進一步進行模型預測，根據綜合評分，其中最高為90.5932，其最優提取條件為：加水量12 倍，煎煮次數3 次（2.47），每次1 h。結合實際生產，節能減排，確定最佳提取工藝為加水量12 倍，煎煮次數2 次，每次1 h。

4.2 提取工藝的驗證試驗與結果

按最佳工藝制備樣品，照上述方法測定，浸膏得率和毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸轉移率均較高，驗證結果為該提取工藝可行和穩定，見表2。

表2 提取工藝驗證試驗結果（n = 3）

5.討論

本實驗選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、綠原酸的轉移率和浸膏得率作為提取工藝的評價指標，基于毛蕊異黃酮葡萄糖苷為本方黃芪的主要活性成分，且檢測方法成熟、分離度好、專屬性強，賦予其50%權重；綠原酸作為石韋的主要活性成分，賦予30%權重；充分考慮到本方作為復方中藥制劑供臨床使用，其藥效物質基礎為多成分共同作用，體現方劑其他配伍藥材的評估，將浸膏得率賦予20%權重。利用綜合評分多指標權重結合響應面法進行工藝優選，保證了提取工藝研究的可靠性和合理性。通過響應面法的回歸分析和方差分析的結果，初步確定葆腎1 號的提取工藝條件，同時考慮到生產實際成本、能源消耗以及環境污染等因素，確定最佳提取工藝。