西地那非對野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓中Notch- 1/Jagged- 1通路的影響研究

向貽佳 蔡昌宏 吳勇輝 葉士勇 趙歡 曾春來

肺動脈高壓是一種以肺動脈壓力升高、右心室肥厚及右心衰竭為特征的惡性血管疾病[1]。目前認為肺血管重塑在肺動脈高壓病理發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其病理過程涉及肺小動脈內(nèi)膜纖維化、中膜肥厚以及管腔狹窄[2-3]。其中Notch 信號通路在肺動脈重塑過程中起著重要作用[4-5]。研究已經(jīng)證實西地那非能通過抑制磷酸二酯酶、發(fā)揮內(nèi)皮保護作用等改善肺動脈高壓[6-8]。基于Notch 信號通路及西地那非在肺動脈平滑肌細胞重塑中的作用，本文探討西地那非對野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓血管重塑過程中Notch-1/Jagged-1 信號通路的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 選擇雄性SD 大鼠（年齡6～8 周，體重250～300 g）42 只，購于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，飼養(yǎng)在無特定病原體級環(huán)境中，溫度（21±1）℃，濕度（55±5）%，給予標準飲食及飲用水。野百合堿（C2401） 購自美國Sigma 公司，Notch-1 抗體（ab52627） 購自英國Abcam 公司、Hes-1 抗體（ab71559） 購自英國Abcam 公司、Jagged-1 抗體（ab7771） 購自英國Abcam 公司、α-SMA 抗體（ab5694） 購自英國Abcam 公司、GAPDH 抗體（5174S）購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及給藥 42 只大鼠采用隨機數(shù)字表法分成3 組，模型組16 只、西地那非組16 只及對照組10 只。模型組及西地那非組大鼠一次性背部皮下注射野百合堿溶液60 mg/kg 建立肺動脈高壓模型，對照組背部皮下注射0.8 mL 0.9%氯化鈉注射液。造模3 周后西地那非組予西地那非100 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)2 周，每周測體重1 次，根據(jù)大鼠體重調(diào)整西地那非用量（100mg·kg-1·d-1）。西地那非給藥期間，模型組及對照組予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.2.2 右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）及右心肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RI）測定 至給藥第5 周末，存活大鼠用4%水合氯醛麻醉后固定，剪去頸部毛發(fā)，依次切開皮膚、皮下組織，分離右側(cè)頸外靜脈，結(jié)扎遠心端，采用右心導管法，Medlab 生物信號記錄儀記錄RVSP。測壓結(jié)束后，自右心室導管注入10%氯化鉀溶液處死動物，分離心臟及肺。剪去心房，分離右心室和左心室+ 室間隔，分別稱重，計算RI。RI= 右心室質(zhì)量/（左心室質(zhì)量+ 室間隔質(zhì)量）。右肺置于4%多聚甲醛中固定，其余肺立即置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 肺組織肺小動脈病理檢查 右肺組織在4%多聚甲醛中固定72 h 后，取右肺上葉組織經(jīng)過不同濃度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，切成3～5 μm薄片。采用HE 和Masson 染色方法觀察肺小動脈形態(tài)及纖維化情況。

1.2.4 Notch-1、Hes-1、Jagged-1 及α-SMA 表達水平的檢測 取冰凍的肺組織100 mg （每組6 個樣本），以冰PBS 漂洗3 次，剪成細小的碎片，按每20 mg 組織加入150～250 μL 裂解液的比例，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的組織細胞快速裂解液，采用勻漿器勻漿直至肺組織完全裂解。將裂解后的樣品以4 ℃12 000 g 離心15 min，取上清液，用蛋白定量法進行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。經(jīng)過配膠（10%分離膠分離膠+ 濃縮膠）、上樣（每孔蛋白80 μg）、電泳、轉(zhuǎn)膜、化學發(fā)光檢測靶蛋白條帶，軟件分析灰度值，與內(nèi)參GAPDH 比較，得出靶蛋白Notch-1、Hes-1、Jagged-1 及α-SMA 相對含量。

1.2.5 肺小動脈中α-SMA 表達水平的檢測 石蠟切片通過脫蠟、水化及PBS 漂洗后，隨后進行抗原修復與阻斷，孵育α-SMA 抗體及二抗，蘇木素復染，清洗，脫水及封片。光學顯微鏡下觀察肺小動脈染色情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Graph Pad Prism（vision 7.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠RVSP 及RI 比較 第5 周末，模型組、西地那非組及對照組存活大鼠分別為8、10、8只。3 組大鼠RVSP 及RI 比較見表1。

由表1 可見，模型組RVSP 和RI 均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。西地那非組RVSP 和RI 均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 3 組大鼠RVSP 及RI 比較

2.2 3 組大鼠肺小動脈病理檢查結(jié)果比較 見圖2（見封三）。

由圖2 可見，HE 及Masson 染色顯示，與對照組比較，模型組肺小動脈明顯增厚、纖維化增加。西地那非組肺小動脈結(jié)構(gòu)異常較模型組改善。

2.3 3 組大鼠肺組織中靶蛋白Notch-1、Hes-1 以及Jagged-1 表達比較 見圖3。

由圖3 可見，模型組Notch-1、Hes-1 及Jagged-1表達水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。西地那非組Notch-1、Hes-1 及Jagged-1表達水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖3 3 組大鼠肺組織中靶蛋白Notch-1，Hes-1 以及Jagged-1 表達比較（A：3 組大鼠Notch-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Notch-1/GAPDH 柱狀圖；B：3 組大鼠Hes-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Hes-1/GAPDH 柱狀圖；C：3 組大鼠Jagged-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Jagged-1/GAPDH 柱狀圖；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 3 組大鼠肺小動脈α-SMA 蛋白表達比較 見圖4（見封三）。

由圖4 可見，模型組α-SMA 表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。西地那非組α-SMA 表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 3組大鼠肺小動脈α-SMA 蛋白表達比較（A：3 組大鼠肺小動脈α-SMA 免疫組化，×400；B：3 組大鼠α-SMA、GAPDH 蛋白電泳圖；C：3 組大鼠α-SMA/GAPDH 柱狀圖；**P＜0.01）

3 討論

肺動脈高壓是一種嚴重的惡性血管疾病，本研究采用皮下注射野百合堿溶液建立肺動脈高壓模型。本研究結(jié)果表明，野百合堿注射5 周后RVSP 及RI 明顯升高，提示成功建立野百合堿誘導的肺動脈高壓模型。西地那非干預后，RVSP 及RI 明顯下降，說明西地那非可改善肺動脈高壓，研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[9-12]。本研究還觀察發(fā)現(xiàn)，建模后肺小動脈明顯增厚、纖維化增加，而西地那非干預后上述表現(xiàn)得到改善。

目前已知肺血管重塑在肺動脈高壓形成過程中起著關(guān)鍵作用，涉及細胞肥厚、增殖、遷移、凋亡及細胞外基質(zhì)沉積等病理改變。多種細胞及細胞因子參與血管重塑。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路在細胞凋亡及血管重構(gòu)中起著重要作用[13-16]，且Notch 信號通路也參與了肺動脈高壓形成病理過程[17-19]。Notch信號通路包括4 種受體（Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4） 和5 種 跨膜 配 體（Jagged-1、Jagged-2、Delta-like 1、Delta-like 2、Delta-like 3）[20-21]。研究表明，Notch 受體1、3 和4 以及配體Dll4、Jagged-1 和Jagged-2 在動脈系統(tǒng)中高度表達，對維持正常血管結(jié)構(gòu)、凋亡及血管重構(gòu)起著重要作用[16]。受體胞外區(qū)和相鄰細胞上的配體結(jié)合導致受體構(gòu)象改變，暴露蛋白水解酶切位點，Notch 胞內(nèi)段經(jīng)分解酶水解進入細胞核并與重組信號結(jié)合蛋白J 結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因（Hes/Hey，ERBB2，Id 等），從而發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)野百合堿誘導的肺動脈高壓模型Notch-1、Jagged-1 及Hes1 蛋白表達明顯增加，西地那非可抑制上述蛋白的表達。此外，血管平滑肌中α-SMA 表達水平在肺動脈高壓模型中明顯升高，而西地那非干預后可抑制其表達。 本研究進一步證實Notch-1/Jagged-1 信號通路參與野百合堿誘導的肺動脈高壓形成過程，而西地那非能夠抑制野百合堿誘導的肺動脈高壓中Notch-1/Jagged-1 信號通路。

綜上所述，Notch-1/Jagged-1 信號通路在野百合堿誘導的肺動脈高壓中活化，而西地那非能夠抑制肺動脈高壓中Notch-1/Jagged-1 信號通路，為西地那非用于治療包括肺動脈高壓在內(nèi)的血管重構(gòu)性疾病提供了實驗基礎(chǔ)。但本研究存在不足之處，西地那非是否通過Notch-1/Jagged-1 信號通路直接作用于肺動脈平滑肌細胞，從而抑制肺動脈重構(gòu)仍有待進一步體內(nèi)外實驗證實。