關(guān)于采用計(jì)時(shí)酵母菌解決面團(tuán)發(fā)酵問題的研究

史珩 嚴(yán)無忌 何佳茜 李政熙 梅一丁

（北京第四中學(xué)，北京 100009）

面包是一種將面粉加水和其他輔助原料等調(diào)勻、發(fā)酵后烤制而成的食品。近年來，因其品種、口味日益豐富，面包作為主食或茶點(diǎn)越來越流行，也有越來越多的人在家自制面包。疫情的蔓延和持續(xù)進(jìn)一步激發(fā)了人們居家烘焙的熱情。國(guó)外調(diào)查表明，英國(guó)在2020 年5 月前短短12 周里，人們?cè)诩彝ズ姹褐械耐度朐鲩L(zhǎng)了49%，很多烘焙原料出現(xiàn)了供不應(yīng)求的現(xiàn)象[1]。在中國(guó)，面包店數(shù)量快速增長(zhǎng)，與此同時(shí)，人們自己烘焙面包也成為時(shí)尚選擇。

然而，面包制作工序較為復(fù)雜，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是面團(tuán)的醒發(fā)，即面團(tuán)發(fā)酵。面團(tuán)的發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，不僅要控制發(fā)酵時(shí)的濕度、溫度，更要掌控發(fā)酵的時(shí)間，而家庭烘焙者因?yàn)椴粔驅(qū)I(yè)、缺乏經(jīng)驗(yàn)，不容易精確控制發(fā)酵時(shí)間，或者忘記時(shí)間而沒有及時(shí)讓面團(tuán)停止發(fā)酵，從而發(fā)酵過度，這些都會(huì)對(duì)面包的保鮮期、口感、柔軟度和形狀等產(chǎn)生很大影響。而具備規(guī)模的連鎖面包房聘請(qǐng)的專業(yè)面包師，多使用冷凍面團(tuán)制作面包。冷凍面團(tuán)采取極速冷凍的方式使酵母菌休眠，以暫停發(fā)酵。但是該過程會(huì)破壞面筋的組織結(jié)構(gòu)。此外，冷凍面團(tuán)運(yùn)送到面包房，需要解凍后進(jìn)行二次發(fā)酵，在解凍的過程中，酵母菌會(huì)恢復(fù)活力并發(fā)酵，面包師無法準(zhǔn)確估量其發(fā)酵程度，從而導(dǎo)致解凍后二次發(fā)酵控制難度增加，極易發(fā)酵過度。

本研究小組利用基因編輯技術(shù)研發(fā)出一種新型的計(jì)時(shí)酵母菌，通過基因控制酵母菌的休眠和喚醒，將其應(yīng)用至面團(tuán)發(fā)酵過程，可大大提高面團(tuán)發(fā)酵的成功率，若最終投入商用，將對(duì)面包行業(yè)的發(fā)展帶來一定的影響。

一、面團(tuán)發(fā)酵

（一）面團(tuán)發(fā)酵原理簡(jiǎn)介

面團(tuán)發(fā)酵是一個(gè)厭氧過程。其原理是：Saccharomyces cerevisiae酵母、野生酵母和乳酸菌[lactic acid bacteria（LAB）]這三種微生物，將面粉中的淀粉、多糖等運(yùn)用淀粉酶使其分解為單糖后，再通過呼吸作用，將單糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳、酒精、乳酸等物質(zhì)[2]。

（二）面團(tuán)發(fā)酵過度的原因分析及研究思路

影響面團(tuán)發(fā)酵的因素很多，例如溫度、濕度、面團(tuán)含糖量、含鹽量等，但用來控制發(fā)酵程度的途徑主要為時(shí)間。

面團(tuán)經(jīng)過一定時(shí)間的適度發(fā)酵，其產(chǎn)生的二氧化碳可以支持面筋蛋白，使面包具有一定的結(jié)構(gòu)而不塌陷，適度的乳酸也使得面包具有了獨(dú)特的風(fēng)味。但是當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，面團(tuán)過度發(fā)酵產(chǎn)生的過量二氧化碳，會(huì)破壞面筋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致面包塌陷，過量的酒精及乳酸也會(huì)影響面包的口感和風(fēng)味。

基于此，研究小組針對(duì)發(fā)酵時(shí)間的控制提出思路：研發(fā)一種計(jì)時(shí)酵母菌，在一定時(shí)間后酵母菌自動(dòng)死亡，從而發(fā)酵過程終止。

二、基因編輯技術(shù)

（一）基因編輯技術(shù)原理簡(jiǎn)介

基因編輯（gene editing），又稱基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種新興的、能比較精確地對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)。

早期的基因工程技術(shù)只能將外源或內(nèi)源遺傳物質(zhì)隨機(jī)插入宿主基因組，基因編輯則能定點(diǎn)編輯想要編輯的基因。

基因編輯依賴于經(jīng)基因工程改造的核酸酶來對(duì)目的基因進(jìn)行編輯和定向改造，該核酸酶也稱“分子剪刀”，其DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別、結(jié)合靶DNA 的特定位點(diǎn)，對(duì)DNA 進(jìn)行切割、修飾等操作。

基因編輯以其能夠高效率地進(jìn)行定點(diǎn)基因組編輯，在基因研究、基因治療和遺傳改良等方面展示出了巨大的潛力。[3]

（二）對(duì)酵母進(jìn)行基因編輯

在基因編輯出現(xiàn)100 多年后，人們發(fā)現(xiàn)了理想的可以基因編輯的對(duì)象——Saccharomyces cerevisiae，它不僅具備容易操作且安全的優(yōu)點(diǎn)，還是運(yùn)用在基因編輯中的首個(gè)酵母。該酵母具有高效率的同源重組機(jī)制，也是第一個(gè)具有完整基因序列的真核生物。目前，酵母已經(jīng)成為一個(gè)用于生產(chǎn)抗生素或疫苗等眾多產(chǎn)品的平臺(tái)，被譽(yù)為“21 世紀(jì)生物的實(shí)驗(yàn)對(duì)象”。

三、計(jì)時(shí)酵母菌基因設(shè)計(jì)

（一）初步設(shè)計(jì)

研究小組沒有對(duì)酵母菌自身進(jìn)行編輯，而是在體外將目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒（圖1 左上），將其導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞（圖1 右上）后組成轉(zhuǎn)化細(xì)胞（圖1 中下），導(dǎo)入酵母菌體內(nèi)。

最初的設(shè)想是設(shè)計(jì)一個(gè)以toggle switch（撥動(dòng)開關(guān)）為原理的通路。如圖2，Toggle switch 由兩個(gè)互相抑制的啟動(dòng)子蛋白組成——lac 蛋白（P lac）和lambda 蛋白（Pλ）。啟動(dòng)子的構(gòu)建方式是把原核生物啟動(dòng)子添加到真核生物啟動(dòng)子TATA 序列的下游。相關(guān)研究表明這種方法可以構(gòu)建高效的真核啟動(dòng)子[3]。

在酵母菌被激活后，cI 蛋白抑制蛋白和毒素蛋白的表達(dá)。在開關(guān)外，一個(gè)半乳糖啟動(dòng)子控制另一個(gè)lacI（lac inducer，lac 蛋白的誘導(dǎo)子）基因的表達(dá)。在系統(tǒng)加入半乳糖被后，lacI 得以表達(dá)，誘導(dǎo)撥動(dòng)開關(guān)轉(zhuǎn)到另一種狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，毒素蛋白開始表達(dá)和積累。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可以通過調(diào)整撥動(dòng)開關(guān)中的啟動(dòng)子強(qiáng)度，生產(chǎn)具有不同發(fā)酵時(shí)間的計(jì)時(shí)酵母菌。

（二）初步設(shè)計(jì)的不足與改進(jìn)

首先，初步設(shè)計(jì)沒有充分考慮基因工程帶來的食品安全問題。雖然上述通路設(shè)計(jì)過程產(chǎn)生的毒素對(duì)人體無害，但是公眾仍會(huì)本能地對(duì)毒素產(chǎn)生排斥反應(yīng)。

其次，該設(shè)計(jì)需要連續(xù)的lacI 蛋白積累，如果用半乳糖啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)這個(gè)功能，半乳糖的量將很難控制。半乳糖太少，則半乳糖很快會(huì)被耗盡；太多則會(huì)影響面包的口感和風(fēng)味。

為改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究小組采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母菌代替毒素蛋白部分，以達(dá)到相同目的，并且在通路里加入整合酶，使lacI 可以在半乳糖的單次刺激后持續(xù)積累。整合酶是來自病毒的酶，可以使病毒的DNA 整合到其寄主的特定識(shí)別位點(diǎn)。如果把噬菌體和細(xì)菌的結(jié)合位點(diǎn)放在DNA 序列的兩端，整合酶會(huì)識(shí)別這些位點(diǎn)，并翻轉(zhuǎn)二者中間的序列[6]。

改進(jìn)后的設(shè)計(jì)如下：

1.最初狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，撥動(dòng)開關(guān)處于“關(guān)”的狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)素的互補(bǔ)基因得以表達(dá)，使酵母獲得營(yíng)養(yǎng)，可以正常工作。

2.通路的起始與激活

在加入半乳糖（烘焙原料之一）后，半乳糖會(huì)激活pGAL 啟動(dòng)子，起始整合酶的表達(dá)，如圖3。整合酶的表達(dá)使啟動(dòng)子與lacI 基因排成一條直線，翻轉(zhuǎn)lacI 上游的啟動(dòng)子序列，lacI 開始表達(dá)和積累，如圖4。

lacI 撥動(dòng)開關(guān)打開，抑制撥動(dòng)開關(guān)的另一部分——CI 序列（如圖5）的表達(dá)，導(dǎo)致CI 濃度下降。

該設(shè)計(jì)通路，可以讓撥動(dòng)開關(guān)的兩個(gè)產(chǎn)物的濃度維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，在半乳糖被移除的情況下其功能也不受影響。

3.發(fā)酵終止

當(dāng)lacI 過度表達(dá)時(shí)，與之互補(bǔ)的CI 基因的表達(dá)停止，CI 濃度大幅下降，下游基因營(yíng)養(yǎng)物（亮氨酸）的表達(dá)也隨之終止，濃度大幅下降，酵母因?yàn)槿鄙俦匦锠I(yíng)養(yǎng)素而進(jìn)入休眠狀態(tài)，發(fā)酵暫停（如果不需要二次發(fā)酵，也可以就此停止發(fā)酵）。

（三）計(jì)時(shí)酵母菌的時(shí)間控制研究

不同種類面包所需發(fā)酵時(shí)間不同，因此需要不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。為此，基于前輩研究的基因表達(dá)生化反應(yīng)速率公式[7][8][9][10][11]，研究小組推出了如下新的建模公式：

公式（1）和公式（2）中，μ 是抑制蛋白1 號(hào)的濃度；v 是抑制蛋白2 號(hào)的濃度；α1 是抑制蛋白1 號(hào)的有效合成率，α2 是抑制蛋白2 號(hào)的有效合成率；γ 是對(duì)啟動(dòng)子1 號(hào)的抑制的協(xié)同性，β 是對(duì)啟動(dòng)子2 號(hào)的抑制的協(xié)同性。

建模后，研究小組先用一至兩對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的有效合成率和協(xié)同性，對(duì)參數(shù)進(jìn)行賦值，并擬合出關(guān)于啟動(dòng)子強(qiáng)度與發(fā)酵時(shí)間關(guān)系的圖像，以便對(duì)模型進(jìn)行調(diào)整，如圖6。其中，假設(shè)的參數(shù)為α1=4；α2=4；β=2；γ=2：。

在經(jīng)調(diào)整找到最佳公式（模型）后，可以不必每一次都做實(shí)驗(yàn)，而是通過計(jì)算，直接找出針對(duì)特定發(fā)酵時(shí)間的合適的啟動(dòng)子強(qiáng)度，從而生產(chǎn)出不同控制時(shí)間的計(jì)時(shí)酵母菌。

四、結(jié)語

（一）計(jì)時(shí)酵母菌的應(yīng)用前景

計(jì)時(shí)酵母菌目前的主要目標(biāo)客戶是家庭烘焙者和冷凍面團(tuán)生產(chǎn)商。

針對(duì)計(jì)時(shí)酵母菌的原理、特征和優(yōu)勢(shì)，研究小組已經(jīng)在幾所學(xué)校做了公眾宣講，并在社交媒體上對(duì)此進(jìn)行了廣泛宣傳，收集了公眾對(duì)于這個(gè)研究成果的看法。很多人對(duì)該項(xiàng)目表示期待，計(jì)時(shí)酵母菌的應(yīng)用將對(duì)他們很有幫助。但是，仍有不少受訪者對(duì)基因編輯產(chǎn)品抱有排斥與戒備的心理，這主要是因?yàn)樗麄儗?duì)基因編輯沒有充分的了解，而近年來關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品安全問題的爭(zhēng)論未能有效消除人們的顧慮，甚至由于缺乏公共說理，加劇了人們對(duì)基因技術(shù)及應(yīng)用態(tài)度的撕裂，部分人仍是“談基因色變”。業(yè)內(nèi)人士則持相對(duì)理性的態(tài)度，其中，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)梁建芬教授認(rèn)為“研究并推廣基因編輯的計(jì)時(shí)酵母菌有創(chuàng)意和可實(shí)施性，不過公眾對(duì)于基因編輯產(chǎn)品，尤其是與食物相關(guān)的，有一定抵觸心理，這是基因研究工作者需要關(guān)注的”。面包坊從業(yè)者表示看好產(chǎn)品的前景，目前最重要的是產(chǎn)品的成熟度和穩(wěn)定性。

研究小組認(rèn)為，隨著基因技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，基因編輯及分子生物學(xué)相關(guān)知識(shí)的普及化，并且在基因產(chǎn)品經(jīng)受了一定時(shí)間的檢驗(yàn)后，人們對(duì)計(jì)時(shí)酵母菌運(yùn)用于面包生產(chǎn)的抵觸心理也會(huì)逐漸消失。

下一步，研究小組還將通過多次實(shí)驗(yàn)，以確保通路設(shè)計(jì)的可靠性。在實(shí)驗(yàn)成功后，會(huì)將計(jì)時(shí)酵母菌參與生產(chǎn)的面包提交政府相關(guān)部門審核，在政府批準(zhǔn)后，再通過市場(chǎng)調(diào)研和可行性研究評(píng)估，進(jìn)一步考慮商用，投入生產(chǎn)。

（二）未來展望

研究小組現(xiàn)有的設(shè)計(jì)主要針對(duì)一次發(fā)酵的面包，對(duì)于需要二次發(fā)酵的情況，如何讓酵母在走出休眠狀態(tài)之后重啟計(jì)時(shí)系統(tǒng)，仍需進(jìn)一步研究和探索。

此外，在應(yīng)用階段，研究小組計(jì)劃尋找降低生產(chǎn)成本的方案，盡可能讓價(jià)格接受度更高，更有利于商業(yè)推廣。