血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑對早期糖尿病腎病患者尿液中足細胞相關蛋白nephrin、自噬基因Beclin-1 mRNA排泄的影響

劉倫志, 鄧 璐, 張明霞

(湖北民族大學附屬民大醫院 腎內科 湖北省腎臟病臨床研究中心 風濕病發生與干預湖北省重點實驗室, 湖北 恩施 445000)

根據中華醫學會內分泌學分會在全國31個省進行的糖尿病的流行病學調查顯示，我國18歲及以上人群糖尿病患病率約為11.2%[1]，其中約有20%～40%的糖尿病患者可能出現糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)[2]。DN已經成為慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)和終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)最主要的的病因之一[3]。在西方國家，DN已成為ESRD的第一大病因[4]。根據中國腎臟病數據系統全國血液透析病例信息登記信息數據，2019年底我國血液透析患者約63萬人，其中DN患者數居第二位，且近10年來發病率呈逐年上升的趨勢，從2011年的15.1%上升至2019年的19.4%[5]。早期DN的診治在慢性病的防治中有著重要的意義。足細胞損傷在DN的發生、發展過程中起關鍵的作用[6]，雖然腎穿刺活檢已經廣泛普及，但由于有創性，糖尿病患者對其接受程度不高，導致早期DN患者在病理水平的研究較為困難。在DN發展過程中，患者足細胞在高糖、氧化應激、自噬等損傷因素作用下其結構和功能均發生改變，部分足細胞錨鏈蛋白缺失、凋亡、脫落而隨尿液排出體外。檢測尿液中足細胞相關蛋白或基因就成為一個無創地了解足細胞損傷的措施[7]。本研究旨在探討血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑(angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers, ARB)氯沙坦對早期DN患者尿液足細胞相關蛋白nephrin、自噬基因Beclin 1 mRNA排泄的影響，探討足細胞的損傷機制及ARB的保護作用。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2018年1月-2021年1月于我院確診資料完整的2型糖尿病患者48例為DN組。選取同期年齡匹配的健康志愿者30例為對照組。DN組男26例，女22例，對照組男16例，女14例，差異無統計學意義(P>0.05)。DN組39～79歲，平均(55.7±16.3)歲, 對照組34～71歲，平均(51.3±19.5)歲，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究通過醫院倫理委員會論證批準。

1.1.1入選標準 符合早期DN診斷標準[8]，3～6個月重復尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin creatinine ratio，UACR)為30～300 mg/g，腎功能測定內生肌酐清除率在60 ml/min以上，均用胰島素控制血糖且達標。

1.1.2排除標準 ①有其他原發或者繼發腎臟疾病，如急慢性腎炎，腎病綜合征，IgA 腎病，過敏性紫癜腎炎，免疫性疾病腎損害，惡性腫瘤等疾病；②尿路感染；③內生肌酐清除率小于60 ml/min；④大量蛋白尿；⑤血糖控制不良；⑥正在或3個月內曾經服用血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin-converting-enzyme inhibitors, ACEI)或ARB類藥物；⑦對氯沙坦及其輔料過敏。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器 兔抗大鼠Podocalyxin多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體(均購自Santa Cruz)，Trizol試劑盒(Invitrogen)，Rt-PCR試劑盒(Invitrogen)，nephrin及Beclin-1引物(天工生物合成)，倒置熒光顯微鏡成像系統(IX71，奧林巴斯)，實時熒光定量PCR儀(Roche Ligh-tCycler 480)。

1.2.2治療 DN組給予氯沙坦50 mg/d (杭州默沙東制藥)治療，監測患者血壓、腎功能、血電解質，如能耐受，逐漸加至100 mg/d。觀察時間為6個月。

1.3觀察指標

1.3.1尿液及生化指標 所有納入觀察的病例均常規查肝腎功能、血糖、血脂、血尿酸、血常規、糖化血紅蛋白，檢測尿液中微量白蛋白，24小時尿蛋白定量；收集晨尿100 ml， 30分鐘內離心后免疫熒光檢查尿液足細胞排泄個數，應用實時熒光定量PCR檢測尿液中 nephrin，Beclin-1 mRNA 表達。

1.3.2尿液足細胞排泄個數 取新鮮晨尿100 ml，離心5 min(1 500 r/min)，取離心尿沉渣100 μl混勻，倒置顯微鏡仔細觀察，如尿沉渣有單個核細胞者, 取沉渣50 μl置于自動涂片離心機、離心2 min(1 200 r/min), 加丙酮于4 ℃固定, 室溫干燥。將涂片置于PBS浸泡濕潤, 用1% BSA封閉，滴加兔抗Podocalyxin多克隆抗體，4 ℃孵育，對照滴加PBS，然后滴加FITC標記羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，加入碘化丙啶0.25 μg/ml于標本上復染細胞核, 室溫下避光孵育5 min, PBS 漂洗, 50%甘油封片, 熒光顯微鏡580 nm波長觀察，顯微鏡下類圓形綠色有核染者為足細胞。選取20個連續不重疊高倍顯微鏡下足細胞計數(個/20個視野)。

1.3.3尿液中nephrin、Beclin-1mRNA表達 收集新鮮晨尿100 ml，為盡量減少RNA酶的分解，于30分鐘內迅速離心(1 500 r/min，5 min)，丟棄上清液，采用Trizol一步法提取總RNA，紫外分光光度計在260 nm和280 nm檢測樣品OD值，根據A260/280的比值來判斷RNA樣本純度，如果其比值為1.8～2.0表示樣本RNA合格。nephrin上游引物為5′-CGGAGAAGACTGAGGCGC-3′，下游引物為5′-TCACACCAGATGTCCCTCAG-3′，產物為459 bp；Beclin-1上游引物為5′-GGGGGTTGCGGTTTTTCTGGGA-3′，下游引物為5′-CTTGCCTTTCTCCACATCCTCCTG-3′，產物為95 bp。按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，實時熒光定量PCR擴增，以βactin為內參照，每個樣本重復3次取平均值。nephrin預實驗確定的擴增條件為：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環30次，終延伸72 ℃ 10 min，最終反應體系為25 μl。Beclin-1預實驗確定的擴增條件為：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 60 s，循環40次。采用2△△Ct法計算相對表達量，△Ct=Ct目的基因-Ct內參，△△Ct=△CtDN組-△Ct對照組。

2 結 果

2.1生化指標比較 對照組空腹血糖、膽固醇低于DN組(均P<0.01)，而DN組治療前后空腹血糖、膽固醇比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。對照組與DN組、DN組治療前后的血漿白蛋白和血肌酐比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1～2。

表1 兩組生化指標比較

表2 DN組治療前后生化指標變化

2.2UACR及足細胞排泄比較 DN組UACR與對照組比較顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)，給予氯沙坦治療6個月后DN組UACR有一定程度下降，差異有統計學意義(P=0.033)；對照組尿液中很難檢測到足細胞，而早期DN患者尿液足細胞排泄增加明顯(P<0.01)。應用氯沙坦治療6個月后， DN組足細胞排泄減少(P=0.038)。見表3～4。

表3 兩組尿液足細胞排泄及UACR比較

2.3DN組尿液中nephrin、Beclin-1 mRNA排泄情況 對照組尿液中nephrin、Beclin-1 mRNA十分微量難以檢出，DN組在應用氯沙坦治療后尿液中nephrin、Beclin1 mRNA表達呈不同的變化趨勢， nephrin mRNA表達較治療前明顯下調，差異有統計學意義(P=0.011)，尿液Beclin-1 mRNA排泄雖然總體呈上調趨勢，但是差異無統計學意義(P=0.067)，見表5。

表4 DN組治療前后尿液足細胞排泄及UACR比較

表5 DN組治療前后尿nephrin、Beclin-1 mRNA排泄

3 討 論

DN是嚴重危害身體健康及導致ESRD的重要疾病之一。全球目前有約3億糖尿病患者，其中約25%～40%發展為DN[9]，我國糖尿病流行病學調查結果與其基本一致。在DN的發病機制中，足細胞損傷的作用越來越受到重視，足細胞受損是DN發展的關鍵[10]。足細胞足突融合、裂孔隔膜損傷、足細胞過度凋亡、足細胞密度下降與DN的蛋白尿、腎小球硬化密切相關。因此，有學者認為DN的本質就是足細胞病[11]。

DN患者足細胞凋亡、錨鏈蛋白丟失，足細胞從基底膜上脫落。一方面基底膜裸露刺激纖維蛋白增生，導致腎小球不可逆硬化，另一方面脫落的足細胞可能出現在尿液中，同時其攜帶的足細胞相關蛋白也會出現在尿液中[12-13]。研究發現，腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)的激活可導致足細胞損傷，抑制RAS激活對足細胞具有保護作用，可以延緩DN的進展[14-15]。但是，這些研究多是動物實驗或者體外研究，對于糖尿病患者的直接研究證據較少。在本研究中也發現正常健康人足細胞排泄很少，難以被檢測到，早期DN患者尿液中足細胞排泄明顯增加，尿液中足細胞相關蛋白nephrin mRNA也同步增加，間接驗證了足細胞受損脫落。而應用氯沙坦后患者足細胞及足細胞相關蛋白nephrin mRNA排泄減少，提示ARB能減少足細胞的脫落，對糖尿病患者足細胞具有保護作用。

自噬在糖尿病足細胞損傷過程中有著重要地位[16]。在RAS激活導致的足細胞損傷過程中自噬也扮演著重要角色[17]。自噬是細胞通過一系列復雜機制降解自身受損的細胞器，是細胞自我更新的一種程序性死亡，以維持細胞的自身穩態。正常情況下，足細胞由于代謝的活躍及所處的特殊地位容易受到損傷，其基礎自噬相當活躍，其代表自噬活性的LC3、Beclin-1通常表達豐富[18]。由于糖尿病患者細胞能量過度，足細胞會下調自噬水平，同時由于DN患者足細胞暴露的損傷及應激因素顯著增加，對自噬的保護性需求增加，這種自噬水平下降和需求增加之間的矛盾會導致細胞老化、細胞損傷、功能障礙，最終加速DN的病理生理過程[19]。本研究也發現尿液中代表自噬活性的Beclin-1 mRNA水平在正常人難以檢測出，可能與健康人足細胞隨尿液脫落排出很少有關，早期DN患者尿液中Beclin-1 mRNA呈低水平表達，應用氯沙坦后雖然尿液中檢出的足細胞排泄減少，但尿液中Beclin-1 mRNA水平反而升高，說明單個足細胞中Beclin-1 mRNA表達水平是有所提高的，提示ARB可能通過提高DN患者足細胞自噬水平達到保護作用。

綜上，對早期DN患者及時應用ARB，減少尿微量白蛋白排泄，保護足細胞，并可能增強足細胞自噬作用，使之收益。