重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠對皮膚創(chuàng)口愈合的療效及其機制

羊劍秋，高以紅，朱紅柳

南京中醫(yī)藥大學江陰附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇江陰214400

皮膚因手術、感染、燒燙傷等各種原因形成的瘢痕影響人體美觀，可對患者的日常生活和社會活動造成嚴重影響。隨著時代的發(fā)展和生活水平的提高，人們對瘢痕美化要求的越來越高，故各種成分的祛疤制劑如硅酮類凝膠、動物膠原蛋白凝膠和類人膠原蛋白凝膠等[1]相繼出現。重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠是一種新型膠原蛋白，可以外源性地給予皮膚補充膠原蛋白，連接皮膚因創(chuàng)傷和感染造成的皮膚纖維斷裂，抑制黑色素生成，抑制瘢痕，加速皮膚愈合[2]。目前，該藥的臨床應用效果報道較少，為此我們就其對創(chuàng)口愈合的療效及其機制進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2019年6月—12月收治手術或外傷無明顯感染皮膚創(chuàng)口患者60例，男24例、女36例，年齡24～45(35.27±3.6)歲。納入標準：①性別不限，手術或外傷后4周內創(chuàng)口，未愈合且未形成瘢痕；②創(chuàng)口無明顯感染；③患者尚未接受過其他治療；排除標準：①瘢痕體質患者；②有傳染性疾病或其他免疫系統重大疾病患者。60例患者采用隨機數字表法分為對照組和觀察組各30例，兩組性別、年齡、臨床癥狀體征比較差異無統計學意義(P均>0.05)。本研究獲本院倫理委員會批準實施，患者及其家屬均知曉并簽署同意書。

1.2 治療方法 對照組采用類人膠原蛋白疤痕修復硅凝膠，根據產品說明書，創(chuàng)口首次清創(chuàng)1周后開始使用，持續(xù)使用12周后停藥。觀察組采用重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠(山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司生產，晉械注準2014264011，每瓶30 g)，從創(chuàng)口首次清創(chuàng)后第3天開始使用，持續(xù)使用12周后停藥。兩組治療前保證創(chuàng)口干燥和潔凈，取適量凝膠在創(chuàng)口處涂抹均勻，每日3次。

1.3 檢測方法 兩組治療前、治療第6周分別行外科顯微手術切取創(chuàng)口組織或瘢痕組織，以0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小置于液氮中保存?zhèn)溆茫M行以下檢測。

1.3.1 羥脯氨酸水平檢測 根據劉平譯《膠原蛋白實驗方法》中提取膠原蛋白的方法提取創(chuàng)口組織或瘢痕組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，將蛋白提取物凍干粉100 mg溶解于1 mL乙酸中，于560 nm波長處在分光光度計下測量羥脯氨酸吸光度。羥脯氨酸水平(mmol/L)=樣品吸光度/標準管吸光度×0.15。

1.3.2 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白比值測定 取0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm的樣本加入5% SDS溶液中，使其樣本∶溶液比例為4∶1。85 ℃水浴45 min，室溫下以10 000 g力離心5 min，取上清液15 μL于離心管中，加入5 μL硫基緩沖液，振蕩混勻。在95 ℃水浴3 min，室溫下以10 000 g力離心5 min，取上清液電泳。采用SDS-Tris-甘氨酸系統電泳緩沖液，0.1%考馬斯亮藍-CH3OH-CHCOOH(9∶9∶2)作為染色液，水-CH3OH-CHCOOH(8∶1∶1)作為脫色液進行電泳4 h。采用Ⅰ型和Ⅲ型標準膠原蛋白定位，根據儀器分析讀取檢測樣本Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白灰度值。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白比值=Ⅰ型膠原蛋白灰度值/Ⅲ型膠原蛋白灰度值×1.5。

1.4 瘢痕狀態(tài)及療效評價

1.4.1 創(chuàng)口容積縮小率 治療前、治療1、2、4周時分別測量創(chuàng)口容積并記錄。測量方法：將醫(yī)用超聲耦合劑注入帶刻度的注射器內，推注射器將耦合劑至創(chuàng)口，以抹平創(chuàng)口耦合劑的劑量作為創(chuàng)口容積，測量后將耦合劑沖洗干凈。創(chuàng)口容積縮小率=(1-目前創(chuàng)口容積/治療前創(chuàng)口容積)×100%。

1.4.2 瘢痕狀態(tài)評定 在治療12周和停藥12周時根據溫哥華瘢痕量表(VSS)評估瘢痕狀態(tài)，包括色澤(0～3分)、柔軟度(0～5分)、厚度(0～4分)。評分越高瘢痕越嚴重。

1.4.3 臨床療效評定 停藥12周測量瘢痕容積，方法同創(chuàng)口容積。臨床療效評價標準：①基本治愈：皮膚基本無肉眼瘢痕印記；②顯效：皮膚瘢痕容積減少超過治療前創(chuàng)口容積一半；③有效：皮膚瘢痕的容積減少超過治療前創(chuàng)口容積的25%；④無效：皮膚瘢痕容積沒有減少。

2 結果

2.1 兩組創(chuàng)口容積縮小率 兩組治療1、2、4周創(chuàng)口容積縮小效率差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。觀察組創(chuàng)口容積縮小率增大，創(chuàng)口容積縮小，創(chuàng)口愈合加快。

表1 兩組不同檢測時點創(chuàng)口容積縮小率比較

2.2 兩組瘢痕狀態(tài)比較 治療12周、停藥12周，觀察組VSS評分中瘢痕色澤、厚度以及柔軟度評分均低于對照組，差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組瘢痕色澤、厚度及柔軟度VSS評分比較(分，

2.3 兩組臨床療效比較 停藥12周，觀察組顯效18例、有效9例、無效3例，總有效率90.00%；對照組顯效12例、有效11例、無效7例，總有效率76.67%。觀察組臨床療效優(yōu)于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 兩組羥脯氨酸水平及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白值比較 治療前兩組羥脯氨酸及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值水平無統計學差異(P均>0.05)；治療6周，觀察組羥脯氨酸水平、Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值低于對照組，差異有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組羥脯氨酸水平及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白值比較

3 討論

瘢痕是創(chuàng)口愈合的必然結果，通常會導致患者外觀美學上的不足、組織運動受限和負面心理壓力[3]。創(chuàng)口愈合一般可分為3個主要階段，即炎癥、增殖和重塑。炎癥始于毛細血管破壞和止血級聯反應的誘導[4]。破損血管中的內容物形成由纖維蛋白網狀物和血小板組成的纖維蛋白凝塊，為臨時細胞外基質；這些臨時細胞外基質可為參與創(chuàng)口愈合過程的各種細胞遷移提供便利。創(chuàng)口愈合的第2階段是增殖，在創(chuàng)傷第4天或第5天開始，成纖維細胞遷移到創(chuàng)口臨時細胞外基質聚集部位。至創(chuàng)傷2～4周，成纖維細胞最大限度地上調，并用更堅固的膠原纖維基質取代纖維蛋白。在增殖成熟的創(chuàng)口中，不能再觀察到初始的彈性纖維網絡，這也是瘢痕堅固和缺乏彈性的原因[5]。增殖期的另一個重要方面是創(chuàng)口邊緣的角質形成細胞內皮化。創(chuàng)口收縮在創(chuàng)傷發(fā)生后第10～12天開始，但這一時間可能會隨著創(chuàng)口的嚴重程度和患者的一般情況而變化[6]。創(chuàng)口愈合的第3個亦是最后1個階段是重塑階段，通常在組織損傷后第3周開始。這一階段顯微鏡下表現包括成纖維細胞數量減少、血管閉塞和膠原纖維硬化[7]。持續(xù)膠原蛋白的產生和降解會對成熟創(chuàng)口基質進行大約6個月的重塑。傷后幾個月的時間內，膠原蛋白生產和退化相互維持平衡，使其總含量無明顯變化[8]。在重塑階段，正在愈合的創(chuàng)口會形成瘢痕。創(chuàng)口瘢痕形成的可調節(jié)因素包括創(chuàng)口設計、軟組織無創(chuàng)處理、止血、無菌技術以及術后皮膚短期或長期張力降低等方法[9]。增殖期甚至在炎癥階段完成之前就已經開始了，即使重塑已經出現，增殖期仍在繼續(xù)。在拆除縫合線和停止使用敷料后很長一段時間內，組織重塑過程仍在繼續(xù)。因此，創(chuàng)口的護理被認為是一個持續(xù)的過程，最大限度地減少瘢痕的形成應該是一個長期目標。

膠原蛋白是細胞外基質的主要組成成分，是動物體內分布最多、含量最廣的蛋白質，主要分布在哺乳動物的結締組織中。在人體組織中，膠原蛋白占干重的70%～80%，其類型主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白[10]。嬰幼兒皮膚中的膠原蛋白主要是Ⅲ型，青壯年和老年人皮膚中的膠原蛋白主要是Ⅰ型。Ⅰ型膠原蛋白決定皮膚輪廓支撐，Ⅲ型膠原蛋白決定皮膚彈性及細膩程度。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平與皮膚的年輕程度、創(chuàng)傷修復、細胞支撐與再生等行為緊密相關[11]。因上皮破損和皮膚萎縮等癥狀都伴隨著膠原蛋白的大量流失，故修復皮膚的主要途徑就是大量補充膠原蛋白。目前，市場上應用的各類膠原蛋白產品大多是動物膠原蛋白或者類人源膠原蛋白，主要來自于常見動物如豬、魚的皮膚。這類產品膠原蛋白的類型主要是Ⅰ型[12]。因提取手段不夠成熟，膠原蛋白的活性結構常常會遭到破壞，最終產品主要以膠原蛋白短肽的形式存在，無法發(fā)揮膠原蛋白的功能，還存在著動物源病毒污染和過敏的風險[13-14]。

重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠是一種通過基因工程技術發(fā)酵生產出來的膠原蛋白凝膠。制作時首先將源自于人類基因庫中的一段Ⅲ型膠原蛋白的基因序列挑選出來，然后通過基因重組的方式將這段經過篩選的優(yōu)良基因片段導入到工程菌中，再通過基因工程發(fā)酵，將氨基酸原料合成為擁有活性結合位點的大分子人源Ⅲ型膠原蛋白，三條多肽鏈之間依靠多組氫鍵網絡進一步穩(wěn)定三螺旋構型，增強了該蛋白的穩(wěn)定性[15]。而且，這一段Ⅲ型膠原蛋白區(qū)域在晶體中呈現出164.88°的柔性彎折結構，更利于該蛋白緊密結合細胞。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征性氨基酸，并且在膠原中的含量較為恒定, 占膠原蛋白氨基酸總量的13%，其水平變化可反映皮膚組織總體膠原蛋白含量變化。皮膚組織中若羥脯氨酸水平過高，則表示膠原蛋白含量過高，提示創(chuàng)口會過度增生出現不同程度的瘢痕。本研究顯示，治療6周觀察組瘢痕組織羥脯氨酸含量顯著低于對照組，提示瘢痕組織增生程度低；而且Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值低于對照組，提示觀察組通過外源性補充重組人源Ⅲ型膠原蛋白，創(chuàng)面局部Ⅲ型膠原蛋白水平升高，從而抑制Ⅰ型膠原蛋白過度分泌造成組織過度增生及瘢痕形成，保持皮膚的良好彈性和柔嫩度，因此觀察組皮膚愈合效果非常理想。

本研究結果顯示，兩組治療1、2、4周，觀察組創(chuàng)口容積縮小率均較對照組升高；治療12周及停藥12周，觀察組瘢痕色澤、厚度以及柔軟度評分均低于對照組；治療后6周觀察組瘢痕組織羥脯氨酸含量降低、Ⅲ型膠原蛋白比例增高；觀察組臨床治療總有效率高于對照組。此機制是由于觀察組外源性補充人源Ⅲ型膠原蛋白，通過其強大的黏附性，有效連接因創(chuàng)傷造成的皮膚斷裂的膠原纖維，從而提高細胞活性，填補細胞間質的空隙，增強細胞間的支撐結構，快速重建皮膚屏障功能。重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠的酪氨酸殘基與皮膚的酪氨酸競爭，與酪氨酸酶的活性中心結合，從而抑制酪氨酸酶催化酪氨酸轉化為多巴醌，也可有效防止皮膚損傷部位的黑色素沉著。

綜上所述，外源性補充重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠可有效提高創(chuàng)面局部Ⅲ型膠原蛋白水平，從而抑制Ⅰ型膠原蛋白過度分泌造成組織異常增生及瘢痕形，減少色素沉淀，臨床治療效果良好。但本研究樣本數量較少，該藥物的確切療效還需要大樣本的臨床實驗觀察證實。