甲狀腺乳頭狀癌關鍵基因的生物學信息分析

王穎，趙玉哲，韓青青，李思佳，張靜

1河北醫科大學研究生學院，石家莊 050000；2河北省人民醫院腺體外科

甲狀腺癌是內分泌系統中常見的惡性腫瘤，近年來發病人數持續增長[1]。2019年國家癌癥中心的統計數據顯示，甲狀腺癌在全人群中發病率已位居第七位，甲狀腺癌逐漸引起關注，但其發病機制還不明確[2]。甲狀腺癌中乳頭狀癌最為常見，高分辨率超聲結合細針穿刺活檢一度被認為是術前診斷甲狀腺癌的黃金搭檔，但部分患者的甲狀腺腫瘤相對較小，從而影響腫瘤性質的精準判斷。

基因芯片又稱DNA微陣列，是一種生物芯片，已成為大規模高效獲取癌癥基因表達譜信息的重要手段。微陣列分析是研究腫瘤基因、尋找腫瘤藥物治療的分子靶點、監測預后的一種新方法。然而，由于實驗樣本的異質性，使用不同的檢測平臺和數據處理方法會導致結果不一致?；诖?，本研究以基因芯片研究為基礎，應用整合的生物信息學技術進行生物信息數據挖掘，對PTC進行全面系統的生物信息分析，以期探索與PTC發生發展相關的關鍵基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 從GEO數據庫(Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE3678、GSE60542、GSE6004和GSE53157數據集。這4個數據集均屬于GPL 570平臺，共包含53個組織樣本，其中包括24個正常甲狀腺組織樣本和29個甲狀腺乳頭狀癌樣本。

1.2 差異基因的篩選 使用R語言Limma R軟件包篩選每個數據集的DEGs。以|logFC|≥1和P<0.05為差異有統計學意義，并將各數據集中的基因按logFC排序，使用RoburRankAggreg(RRA)R包(Https://cran.rstudio.com/bin/windows/contrib/3.5/RobustRankAggreg_1.1.zip)對4組基因文件進行集成，并將上調和下調的DEGs列表保存起來，供后續分析。

1.3 功能注釋和通路富集分析 應用David 6.8數據庫(Https://david.ncifcrf.gov/)對整合的DEGs進行GO注釋和KEGG途徑富集分析，以了解基因參與的生物過程和信號傳導途徑。所有GO富集分析和KEGG途徑分析的數據以P<0.05為差異有統計學意義。

1.4 蛋白質相互作用網絡構建 應用String在線數據庫(http://string-db.org)對412個整合DEGs進行分析，下載分析結果，使用Cytoscape3.8.0軟件構建可視化的PPI關系網絡，并用CytoHubba插件篩選樞紐基因。

1.5 模塊分析 在Cytoscape3.8.0軟件構建的PPI網絡中，使用默認參數為“Degree Cutoff = 2”“Node Score Cutoff = 0.2”“K-Core=2”和“Max.Depth=100”的MCODE插件對PPI網絡中的模塊進行分析。

2 結果

2.1 差異表達基因 數據集GSE3678、GSE60542、GSE6004及GSE53157分別篩選出700、887、772、1 088個DEGs，通過等級分析，鑒定了412個整合的DEGs，包括209個表達上調基因和203個表達下調基因。

2.2 DEGs的功能注釋及富集 GO功能注釋分為三部分：生物過程、分子功能和細胞成分。上調基因主要富集于基因表達的正調控、細胞外外泌體和鈣離子結合，下調基因主要富集于信號轉導、膜的組成部分和鈣離子結合。

2.3 DEGs的KEGG通路 利用DAVID數據庫對集成的DEGs進行了KEGG路徑分析，整合后的DEGs主要富集于5種途徑，即癌癥的途徑、PI3K-Akt信號轉導通路、癌癥中的蛋白多糖、黏著斑，ECM受體相互作用。

2.4 蛋白質—蛋白質相互作用(PPI)網絡 為了確定這些DEGs在PTC中的相互作用，我們利用String在線數據庫對412個整合DEGs進行了分析，并構建了一個PPI網絡。在此基礎上利用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件根據其程度值篩選出前10位核心基因：FN1、CDH2、APOE、TIMP1、CCND1、SERPINA1、MET、LPL、RUNX2、ITGA2，見表1。

表1 前10位樞紐基因的相關信息

2.5 功能模塊 利用Cytoscape軟件中的MCODE模塊從PPI網絡中篩選了14個功能模塊，并選擇了三個最重要的模塊(如圖1)。利用David數據庫對這三個模塊中的所有基因進行了KEGG途徑富集分析(表2)。結果表明，模塊1的基因主要富集于ECM受體相互作用，模塊2的基因主要富集于礦物質吸收，模塊3的基因主要富集于鈣信號通路、癌癥中的中心碳代謝、癌癥的途徑。

表2 前三個模塊中基因的KEGG富集

注：圓圈代表基因；線條代表基因編碼蛋白質之間的相互作用；線條顏色代表蛋白質相互作用的類型。

3 討論

甲狀腺癌是目前全球增長速度最快的癌癥，其中PTC占比逐漸上升，已成為甲狀腺癌診治的焦點。當甲狀腺結節經過細針穿刺活檢(FNA)確診或可疑癌腫時，推薦首選手術切除。但術前仍有部分患者無法通過超聲及細針穿刺活檢確定腫瘤性質，導致一部分不必要的手術。

本研究共篩選出412個整合DEGs，其中209個上調基因和203個下調基因。對差異基因進行GO功能及KEGG通路富集分析發現，上調基因在基因表達的正調控、細胞外外泌體和鈣離子結合等方面存在顯著富集，下調基因在信號轉導、膜的組成部分和鈣離子結合等方面存在顯著富集。這些基因主要參與癌癥的途徑、PI3K-Akt信號轉導通路、癌癥中的蛋白多糖、黏著斑、ECM受體相互作用等與腫瘤發生相關的信號通路。模塊中所涉及基因的KEGG通路分析再次驗證了ECM受體相互作用及癌癥的途徑通路與PTC的發生發展密切相關。我們還構建了包含412個整合DEG的PPI網絡，并鑒定出以下10個樞紐基因：FN1、CDH2、APOE、TIMP1、CCND1、SERPINA1、MET、LPL、RUNX2、ITGA2。FN1是一種細胞外基質高分子糖蛋白，參與協調復雜的細胞黏附和遷移[3]。最新研究發現，FN1促進PTC的遷移和侵襲并預測PTC的淋巴結轉移[4]。

本研究結果顯示，PTC標本中FN1基因均上調，提示高水平的纖維連接蛋白表達可能是腫瘤轉移的促進因子。與楊春偉等[5]研究結論一致。CDH2是經典鈣黏蛋白家族的成員，在多種癌癥中過度表達。體外實驗結果顯示,PTC組織中CDH2含量高于非癌性甲狀腺組織，并通過激活MAPK/ERK、PI3K/Akt和p16/Rb信號通路促進甲狀腺腫瘤的發生[6]，與本研究結果一致。APOE和LPL在脂質代謝中起重要作用，并被認為參與了惡性腫瘤的代謝途徑，為腫瘤細胞提供額外的能量來源[7]。TIMP-1是一種多功能的天然基質蛋白抑制劑，被認為是腫瘤轉移的負調節因子。通過保護細胞外基質的完整性來防止腫瘤細胞的侵襲和轉移[8]，CCND 1/CyclinD 1是細胞周期G1/S期的調節因子[9]。TESHIMA等[10]發現，PTC區域淋巴結轉移率、甲狀腺外擴張率和腺內轉移率與CyclinD 1免疫染色陽性率相關。本研究結果中PTC細胞中CCND1基因上調，CyclinD 1過表達可能是判斷甲狀腺惡性腫瘤生長和轉移潛能的重要指標。

SERPINA1是一種蛋白酶抑制劑，已被認為是多種癌癥的生物標志物。有實驗表明SERPINA1在甲狀腺良惡性結節的鑒別中起重要作用[11]。研究發現,MET在HGF/c-MET通路中起重要作用，與甲狀腺癌亞臨床中心淋巴結轉移密切相關，MET可能是PTC的危險基因[12]。Runx 2是胚胎發生過程中一種重要的轉錄因子，可通過激活一組參與基質降解和細胞侵襲的基因，來調控甲狀腺腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[13]。ITGA2在多種腫瘤中的過度表達，被認為參與了細胞黏附和細胞表面介導的信號傳遞[14]。CHARNAYA等[15]研究發現，BRAF突變的PTC細胞改變了RAS-RAF-MEK通路，導致細胞膜整合素受體及其配體—細胞外基質蛋白骨橋蛋白表達的改變，從而增加腫瘤細胞的轉移潛能。因此，ITGA2可作為腫瘤進展和侵襲性腫瘤表型的潛在生物標志物。

綜上所述,本研究篩選所得的10個關鍵基因可能在PTC發生發展中發揮重要作用，抑制ECM受體相互作用、癌癥的途徑通路可能是治療PTC的有效方法。