流式細胞儀在本科生實驗教學中的實踐

蔣海霞，羅 倩，許 杰，施 敏，張 萍1，b

（上海交通大學a.生命科學技術學院；b.生命科學與技術國家級實驗教學示范中心，上海 200240；2.貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司生命科學事業部，上海 200335）

0 引言

高校大型儀器設備是提高科研水平，提升實驗教學質量、培養高素質人才的重要保障［1-2］。近年來，高校越來越重視本科生的科研能力培養。生物學的快速發展離不開檢測儀器的支持，然而生物學實驗課程往往在教學內容中以理論教學代替大型貴重儀器的實踐教學。因此，有必要對傳統的生物學實驗教學進行一些探索性的實踐，以推動生物學實驗教學改革。

1 高校大型儀器平臺的機遇和挑戰

1.1 高校大型儀器平臺的機遇

近年來，隨著我國高等院校的迅猛發展，高校學科建設日益增強，科研力量不斷壯大，各學院儀器共享平臺在多種學科建設經費和科研經費的支持下，購置了多種大型儀器和設備。據統計，自2008 年以來，大部分高校的大型儀器設備的年增幅都在14%以上［3-4］。大型儀器平臺為學科發展和科研工作提供儀器和相應的技術服務支撐，已經成為國家、高校和科研部門科技創新的“航空母艦”。

我校生命科學技術學院儀器共享與技術服務平臺以微生物代謝國家重點實驗室為載體，整合了學院優勢資源，擁有各類儀器180 余臺（套），共計價值1.5億元；是校內大生命科學平臺中建設最好、體系最大、各項功能相對完善的儀器服務平臺。

1.2 高校大型儀器平臺面臨的挑戰

目前，我國高校，尤其是“985”“211”研究型大學注重大型儀器平臺的建設及學科發展［5-6］，在完成國家級項目、培養碩士和博士研究生方面發揮了積極作用，但是大型儀器在本科生的實驗教學中沒有發揮其應有的作用和潛能［7］。當前的中國，需要培養創新型人才，而創新型本科人才的培養則需要創新的實驗教學。創新的實驗教學需要強化大型儀器平臺尤其是院級儀器平臺的教學功能，將大型儀器用于實驗教學，尤其是本科生的實驗教學。吉林大學生命科學學院和中國藥科大學中藥學院面向本科生開放大型儀器的實踐取得了較好的效果［8-9］。

我校生命科學技術學院儀器共享與技術服務平臺結合自身條件及學科特點，與生命科學與技術國家級實驗教學示范中心合作，在細胞生物學實驗教學課程中利用超高靈敏微孔板檢測成像系統、共聚焦顯微鏡和流式細胞儀開設了相應的課程。在實驗課程設置、實驗教學模式、人才培養中進行了實踐和探索，取得了較好的效果。

2 大型儀器平臺實驗教學課探索

2.1 課程設置及簡介

以流式細胞術為例，在本科生“細胞生物學實驗”課程中設計了利用流式細胞儀檢測細胞周期實驗。儀器平臺分析型流式細胞儀型號為Beckman Cytoflex（見圖1），操作簡單，自2018 年購買后，在研究生科研中使用率很高，2019 年使用達330 人次；2020 年雖然由于疫情影響耽誤了2 個月，但是使用達338 人次。目前，平臺流式細胞儀主要應用于細胞凋亡、細胞周期、活性氧、線粒體膜電位、細胞表面標記、細胞計數等方面的檢測。2018～2019 年使用流式細胞儀的研究生數據統計，研究生在本科階段均沒有使用過流式細胞儀，所以2019 年開始面向我院國家級實驗教學示范中心，結合理論課向本科生開放“利用流式細胞儀檢測細胞周期”的實驗課程，課程總計4 學時，其中1 學時為課程面授，3 學時為實驗課，實驗課時約占總課時的75%，以儀器平臺作為教學的第二課堂，有助于本科生順利進入科研訓練，為將來的研究生階段學習奠定堅實的基礎。

圖1 Cytoflex流式細胞儀

2.2 實驗教學大綱

流式細胞儀（flow cytometer，FCM）能對液流中的生物顆粒（如細胞、微生物和人工合成微球等）逐個進行多參數（包括細胞大小、內部結構、DNA 和RNA 含量、細胞表面或胞內蛋白質分子的表達等）快速定量分析和分選，是當代最先進的細胞定性、定量分析以及細胞分選儀器［10］。目前已廣泛應用于生物學和臨床檢驗等領域［11］。

細胞是生命活動的基本單位，而細胞周期又與細胞的增殖和分化密切相關。因此，對于細胞周期的檢測至關重要［12］。本課程主要介紹流式細胞儀檢測細胞周期的原理、方法，以及該儀器在本科生“細胞生物學實驗”課程教學中的應用。

樓蘭的目光驟然黯淡下來，像一縷極其微弱的火苗，隨時可能熄滅。她的手在西雙的手心里不安地顫抖起來，越來越快，越來越快……

2.2.1 實驗原理

細胞周期（cell cycle）是指細胞從上一次分裂完成到下一次分裂結束所經歷的全部過程，包括分裂間期和分裂期（M 期），其中分裂間期又可分為DNA 合成前期（G1 期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）。PI（碘化丙啶）可以穿過破損的細胞膜與細胞內的DNA結合。DNA結合PI的熒光強度可直接反應細胞DNA 含量的多少，且成正比。細胞周期各時期的DNA含量不同。G0/G1 期具有二倍體細胞的DNA含量（2N）；G2/M期具有四倍體細胞DNA 含量（4N）；S期的DNA含量介于2N 和4N 之間。因此，可以用流式細胞儀檢測PI 的熒光強度計算細胞周期各時期的百分比。

2.2.2 實驗教學設計

以秋水仙素對中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary Cell，CHO）細胞周期的影響為研究對象，結合操作難度和時間等因素，在本科生“細胞生物學實驗”課程教學中開展細胞周期檢測實驗。流式細胞儀的教學可分成理論教學和實驗操作兩部分。理論教學部分主要以教師集中授課方式進行，根據實驗指導向學生講授細胞周期檢測實驗的原理、方法、步驟、注意事項及應用等。實驗操作部分則為學生實踐，數據采集采取現場教學的方式對學生進行儀器使用培訓；然后根據儀器使用情況及班級人數，分組進行細胞周期的檢測；最后分析實驗結果，完成實驗報告。

3 教學實例

3.1 儀器

Cytoflex流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）

3.2 實驗方法

3.2.1 樣品制備方法

取對數生長期的CHO 細胞接種于6 孔細胞培養板中。在5% CO2、37 ℃的條件下培養細胞，細胞完成貼壁后，實驗組加入秋水仙素（終濃度10 μg/mL），對照組加入相同體積的生理鹽水，18 h 后用胰蛋白酶分別處理并收集對照組及實驗組細胞。用2 mL 預冷的PBS洗滌細胞，調整細胞濃度為1 ×106個/mL。取2 mL單細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，去除上清液后，逐滴加入-20 ℃預冷的終濃度為70%的乙醇，4℃固定1 h。取出固定后的樣品，低速離心去除上清液。用2 mL預冷的PBS 重懸細胞后，低速離心收集細胞。用0.5 mL預冷的PBS 重懸細胞，加入2.5 μL RNaseA（終濃度為50 μg/mL），37 ℃孵育30 min。最后加入25 μL PI 工作液（終濃度50 μg/mL），室溫避光染色5～30 min，用200 目篩網過濾樣本后上機。

圖2 對照組細胞周期的流式檢測圖

3.3 結果與討論

3.3.1 實驗結果

流式檢測結果如圖2 C和圖3 C所示。將FCS格式數據導入到Modfit 軟件中，先建第1 個門（見圖4 A），橫坐標為FSC，縱坐標為SSC；利用“門”工具對細胞群進行設門（注意左下腳為細胞碎片，不圈）。再建第2 個門（排除黏連體）（見圖4 B），橫坐標為FL2-H PE-H，縱坐標為FL2-A PE-A，選中X 軸，在“Edit X parameters”中選擇“Fixed upper boundary”和“Linear”；最后選擇“analysis population”，橫坐標為FL2-A PE-A，選擇“Auto”進行擬合周期分析。先分析擬合對照組的周期，再在同樣的模板下分析擬合實驗組的周期，最終獲得對照組和實驗組的G1，S，G2 期的比例。分析擬合結果如圖4 C 所示，對照組細胞的細胞周期各時相分布為G1 期為66.54%，S期為19.7%，G2/M期為13.76%。秋水仙素處理組細胞的細胞周期各時相分布為G1 期為10.85%，S 期為14.71%，G2/M 期為74.44%（見圖5 C）。這表明10 μg/mL的秋水仙素處理18 h導致細胞周期阻滯在G2/M期。

圖3 實驗組細胞周期的流式檢測圖

圖4 對照組細胞周期分析擬合圖

圖5 實驗組細胞周期分析擬合圖

3.3.2 討論

對照組和實驗組的%CV（Coefficient of Variance，CV）值分別為3.52 和3.98，都小于5%，說明G0/G1期的峰正常。對照組和實驗組的RCS（Reduced Chi-Square，RCS）值分別為1.755 和2.331，都在要求的0.9-3.0 之間，說明所選擇的模式與標本的擬合程度較好。

3.3.3 實驗注意事項

（1）使用的玻璃器皿和試劑要干凈滅菌，這點很重要。污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，從而影響最終分析質量。

（2）使不同樣本含有數目一致的細胞，從而排除染料和DNA之間比率的較大變化。PI和DNA結合的絕對值受樣本處理過程的影響，尤其是固定的方法，所以對研究對象做統一的標準試驗過程是很重要的。

（3）低速上樣（每秒進樣細胞數500 個左右，進樣速度太快會導致峰形較寬，1 h 內上機，染色與檢測的時間過長也容易造成CV增大。

（4）熒光通道線性放大，同時還要注意用AH參數設門排除粘連體。

（5）獲取單個有效細胞數至少10 000 個。

3.3.4 教學效果

該實驗教學涵蓋了從細胞樣本制備到上機檢測及結果分析的所有步驟，培養了學生的基本實驗操作技能，提高了學生分析問題的能力。將該實驗內容引入到本科生的生物學實驗教學課程，在最大程度發揮我院大型儀器資源優勢的同時，使本科生接受良好的專業訓練。

4 結語

目前，第二軍醫大學海醫系［13］、貴州大學農業生物工程研究院［14］、河北北方學院生命科學研究中心［15］和南方科技大學生物系生命科學實驗教學示范中心［16］等單位都已在本科生實驗教學中進行了流式細胞儀的教學探索，取得了較好的成效。自2019 年以來，我院儀器平臺流式細胞儀在本科生的細胞生物學實驗教學已開放3 年，在實驗教學模式改革創新和提升學生實踐技能方面取得了一定成效。如2019 年和2020 年參加過該實驗教學課的幾位本科生在項目中使用流式細胞儀參加國際基因工程機器大賽（iGEM）分別獲得金獎和銀獎；2019 年參加過該實驗教學課的1 位本科生在項目中使用流式細胞儀參加第十六屆“挑戰杯”全國大學生學術競賽獲得特等獎。由于我院儀器共享與技術服務平臺依托于微生物代謝國家重點實驗室，很多研究生在微生物科研中均需使用流式細胞儀，所以將流式細胞儀進一步推廣至本科生微生物實驗教學，培養和提高他們的實踐動手能力和科學素養。