采用分子模擬方法探究巨噬細(xì)胞移動抑制因子與異噁唑類抑制劑的結(jié)合模式及相互作用

李煥婷 ，許磊 ，楊敏，高博聞

（1.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.江蘇理工學(xué)院生物信息與醫(yī)藥工程研究所，江蘇常州 213001）

巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種具有促炎作用及免疫抑制作用的細(xì)胞因子，由巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞分泌，參與多種炎癥和自身免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球腎炎、糖尿病、動脈粥樣硬化、敗血癥、哮喘、急性呼吸窘迫綜合征等。此外，有研究結(jié)果表明MIF 在腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展中具有重要作用，包括調(diào)控細(xì)胞的增殖和促進血管的生成[1]。在皮膚、大腦、乳房、結(jié)腸、前列腺和肺的腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)了MIF 的過度表達(dá)，提示其與腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。因此，MIF 被認(rèn)為是一個重要的藥物設(shè)計靶點。MIF 具有多種酶的活性，包括D-多巴色素互變異構(gòu)酶（DDT）、苯丙酮酸互變異構(gòu)酶和巰基蛋白氧化還原酶[3-5]。MIF 是一種同源三聚體，催化活性位點位于同源三聚體的兩個相鄰單體之間［6］。N-末端脯氨酸（Pro1）具有不同尋常的pKa 值（5.60±0.10）[7]，是酶活性的關(guān)鍵殘基。通過Pro1 共價修飾或絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸的定點突變可以完全消除MIF的互變異構(gòu)酶活性[8]。

目前，針對MIF 的治療策略包括基于抗體的抗細(xì)胞因子和小分子抑制劑治療[9]，前者雖然可以有效抑制MIF 的生物活性，但是由于高風(fēng)險、高投入及注射不方便等限制了其廣泛應(yīng)用；靶向MIF 的小分子抑制劑已經(jīng)被大量報道，如多巴色素衍生物、對乙酰氨基酚衍生物、苯丙酮酸衍生物、希夫堿類、炔類化合物以及異噁唑類似物等[10]。1997 年，Ⅹue[11]等合成了一系列異噁唑類化合物，其中（S，R）-3-（4-羥基苯基）-4，5-二氫-5-異噻唑乙酸甲酯（ISO-1）作為MIF 的典型抑制劑被廣泛研究。Lubetsky 等［12］修飾ISO-1 骨架結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)和乙酸側(cè)鏈，并測試了這些衍生物對MIFD-多巴色素互變異構(gòu)酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)沒有包含p-羥苯基的衍生物其活性顯著下降，而4-甲氧基類似物完全沒有活性，進一步證實p-羥苯基在MIF 互變異構(gòu)酶抑制的重要性；接著，Lubetsky 等進行了ISO-1 的生物活性研究，證明在成纖維細(xì)胞中ISO-1 可以抑制花生四烯酸的釋放。此外，ISO-1 還強烈拮抗MIF 依賴的抗炎藥物地塞米松的抑制作用。Al-Abed 等[13]進一步研究了ISO-1對MIF抑制的治療潛力，證實ISO-1可以抑制MIF 的促炎活性，免受膿毒癥和感染性休克的影響；通過細(xì)胞培養(yǎng)證實ISO-1 可以抑制MIF的互變異構(gòu)酶活性和內(nèi)毒素引起的TNF 的釋放。Yousef 等［14］通過改變ISO-1 的烷基鏈獲得了不同的脂肪、芳香酯類和酰胺類化合物（表1），實驗證明脂類取代的衍生物相比酰胺類物質(zhì)具有更強的抑制活性。

表1 ISO-1系列類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及MIF互變異構(gòu)酶活性[14]Table 1 Chemical structure and MIF tautomerase activity of ISO-1 series analogs[14]

為了設(shè)計出抗炎活性更強的ISO-1 抑制劑分子，需要從原子水平深入探究MIF 重要氨基酸殘基與ISO-1 類似物不同取代基對抑制劑結(jié)合的影響。因此，本文基于已知的MIF 與ISO-1（PDB ID：1LJT）及其類似物ISO-66（PDB ID：4K9G）的晶體結(jié)構(gòu)，定量分析了受體-配體的結(jié)合模式及結(jié)構(gòu)決定性因素，接著采用半柔性的Glide分子對接方法中3種不同精度的打分函數(shù)，將已知的ISO-1 系列抑制劑分別對接到MIF 結(jié)合口袋中，構(gòu)建了MIF 與ISO-1類似物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)；通過比較3 種不同精度對接打分與實驗活性的線性相關(guān)性，獲得了最優(yōu)的晶體結(jié)構(gòu)和打分模式，進而以此晶體結(jié)構(gòu)和打分模式對MIF 與ISO-1 系列典型類似物的結(jié)合模式進行分析，在此基礎(chǔ)上設(shè)計了6 個新穎的ISO-1 類似物分子，分子對接打分及成藥性預(yù)測顯示，這些化合物可能具有較強的抗炎活性和較好的成藥性。本文結(jié)果為深入了解MIF 特殊生物學(xué)功能的分子基礎(chǔ)以及治療MIF 相關(guān)疾病藥物的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蛋白、配體準(zhǔn)備

MIF 與ISO-1 及其類似物ISO-66 的晶體結(jié)構(gòu)1LJT、4K9G 來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org），采用Schr?dinger 軟件包中的蛋白準(zhǔn)備模塊Protein PreparationWizard 對MIF 的晶體結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理，包括修正鍵級，添加氫原子及部分電荷。根據(jù)實驗和理論預(yù)測結(jié)果[17]，MIF 氮末端Pro1 保持質(zhì)子化，只保留位于A 鏈和B 鏈的配體，刪除其余2 個配體分子，刪除所有的結(jié)晶水分子，將整個體系基于OPLS-2005 力場進行優(yōu)化，當(dāng)RMSD 值達(dá)到0.03 nm時優(yōu)化終止。采用Schr?dinger中的LigPrep模塊在pH=7.4 條件下產(chǎn)生化合物的可能離子化狀態(tài)和互變異構(gòu)體。

1.2 分子對接

在采用分子對接方法進行虛擬篩選之前，首先需要驗證所采用的Glide 對接方法的有效性，定義MIF 活性位點為以晶體結(jié)構(gòu)中配體分子為質(zhì)心的1 nm×1 nm×1 nm正方體區(qū)域，將MIF中所有部分電荷等于或者小于0.25 的原子范德華半徑比例因子設(shè)為0.4，采用軟對接方法處理MIF 的柔性，在第一步分子對接過程中每個配體最多產(chǎn)生5 000 個構(gòu)象，只將其中打分最好的1 000 個構(gòu)象進行能量最小化，在能量優(yōu)化的過程中將配體分子的介電常數(shù)設(shè)為4，并且進行1 000步的共軛梯度法優(yōu)化。

1.3 成藥性預(yù)測

已知口服藥物分子一般具有類似的理化性質(zhì)，如分子量、脂水分配系數(shù)、水溶解度和氫鍵供體、受體數(shù)目等。本文采用Qikprop 軟件對陽性對照化合物ISO-1 及設(shè)計的6 個新穎類似物進行了成藥性預(yù)測。Qikprop 是一款快速、準(zhǔn)確、簡單易用的成藥性預(yù)測軟件，可以預(yù)測有機小分子與成藥性密切相關(guān)的一些物理化學(xué)描述符，它通過與95%已知藥物分子比較，給出了每種理化性質(zhì)的合理范圍區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIF與ISO-1、ISO-66的結(jié)合模式分析

MIF 是同源三聚體（序列：UniProtKB P14174），相鄰2條鏈之間可以結(jié)合配體分子，在4K9G晶體結(jié)構(gòu)中，A鏈與B鏈之間的配體分子存在2種構(gòu)象，配體顯示為A，為了方便比較，只保留1LJT、4K9G 2個晶體結(jié)構(gòu)中的B鏈、C鏈之間的配體分子。本文詳細(xì)比較了MIF-ISO-1（PDB ID：1LJT）、MIF-ISO-66（PDB ID：4K9G）晶體結(jié)構(gòu)中受體-配體結(jié)合模式。1LJT中ISO-1 配體結(jié)合位點口袋大小為44.374 9 nm3，而4K9G 中ISO-66 配體結(jié)合口袋大小為46.449 3 nm3，可見后者的結(jié)合口袋略大一點。

盡管兩者的結(jié)合口袋大小略有差異，ISO-1、ISO-66 與MIF 結(jié)合模式具有較高的相似性，都位于由多個非極性氨基酸殘基組成的疏水口袋，包括：Pro1、Met2、Ile64、Val106、Phe113 和Tyr209，其 中ISO-1、ISO-66 的芳香環(huán)都可以與Tyr95 的芳香環(huán)形成T-型的π-π 相互作用，與Lys32、Ile64 形成氫鍵相互作用（圖1A、B）。ISO-1 異噁唑環(huán)上的氧原子和氮原子與Lys32 側(cè)鏈上面的伯胺氮原子、Ile64 骨架上的酰胺氮原子間距離均為0.327 nm；ISO-1 酚羥基上面的氧原子與Asn97酰胺基上面的氧原子和氮原子距離分別為0.256、0.259 nm。ISO-66叔胺上的氮原子與Lys32 側(cè)鏈上面伯胺氮原子距離為0.365 nm，與Ile64 骨架上的酰胺氮原子間距離為0.300 nm；ISO-66羥基上面的氧原子與Lys32側(cè)鏈上面伯胺氮原子距離為0.280 nm；ISO-66 酚羥基上面的氧原子與Asn97酰胺基上面的氧原子和氮原子距離分別為0.266 nm和0.335 nm。

2.2 Glide 分子對接分析MIF 與ISO-1 類似物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)

為了驗證Glide 分子對接的有效性，首先將1LJT、4K9G 2 種晶體結(jié)構(gòu)中的配體取出，然后重新對接到MIF 結(jié)合口袋，通過圖1C、D 對比發(fā)現(xiàn)Glide對接方法可以較好地重現(xiàn)配體的結(jié)合構(gòu)象。根據(jù)原始晶體結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象與對接后配體構(gòu)象的均方根偏差值（RMSD）大小，定量評價Glide對接方法對2 種配體的疊合情況。在1LJT 晶體結(jié)構(gòu)中，只考慮配體重原子的RMSD=0.055 nm，而在4K9G 晶體結(jié)構(gòu)只考慮配體重原子的RMSD=0.099 nm，可能由于ISO-1 具有異噁唑環(huán)，而ISO-66 具有更長的脂肪鏈，所以后者具有更大的旋轉(zhuǎn)自由度。

圖1 MIF與ISO-1（A）、ISO-66（B）的2D相互作用示意圖；1LJT（C）、4K9G（D）晶體結(jié)構(gòu)與Glide對接結(jié)構(gòu)中配體構(gòu)象疊合圖Figure 1 2D representation of the interactions between MIF and ISO-1 (A),ISO-66 (B);the superposition of the Glide docked inhibitor and its original structure in the crystallographic complex(C:1LJT;D:4K9G)

晶體結(jié)構(gòu)雖然可以提供受體-配體較為詳細(xì)的結(jié)合模式，但只能顯示單一的靜態(tài)構(gòu)象，同一個蛋白靶點如果針對不同的晶體結(jié)構(gòu)、不同對接精度打分函數(shù)進行虛擬篩選，結(jié)果會有較大差異。在目前廣泛采用的半柔性分子對接過程中，受體的結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，對接口袋大小主要基于配體的結(jié)構(gòu)柔性變化。由于配體分子具有較大的化學(xué)差異性，因此具有不同配體的晶體結(jié)構(gòu)對打分結(jié)果也會具有較大影響。本文基于已知的MIF-ISO-1、MIF-ISO-66的晶體結(jié)構(gòu)，采用Glide 中3 種不同精度（HTVS、SP、ⅩP）的對接打分方法，分別構(gòu)建了MIF 與ISO-1類似物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，接著比較了3 種精度打分方法得到的對接打分與實驗活性的線性相關(guān)性（圖2）。

雖然按照Glide 分子對接打分模式的計算精度，HTVS＜SP＜ⅩP，但從圖2 可見，無論針對1LJT 還是4K9G 的晶體結(jié)構(gòu)，HTVS 結(jié)果都要優(yōu)于SP（r=0.11）及ⅩP（r=0.16、r=0.04）打分模式，1LJT、4K9G 2 種晶體結(jié)構(gòu)中SP 打分產(chǎn)生了完全相同的線性相關(guān)系數(shù)，4K9G-ⅩP 取得了最差的線性相關(guān)系數(shù)（r=0.04），而4K9G-HTVS 取得了最佳的線性相關(guān)系數(shù)（r=0.50）。對接打分取得了不夠理想的線性相關(guān)系數(shù)，可能是因為表1中ISO-1衍生物的抑制活性差異不夠大，同種類型的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有跨越較大的活性梯度，因此沒法較好地進行受體-配體結(jié)合親和力排序。盡管傳統(tǒng)意義上，通常認(rèn)為精度越高的打分函數(shù)與實驗活性會產(chǎn)生最佳的線性相關(guān)系數(shù)，但通過MIF 與ISO-1 類似物活性比較，可以發(fā)現(xiàn)不同晶體結(jié)構(gòu)、不同精度對接打分會產(chǎn)生完全不同的線性相關(guān)性，因此在進行大規(guī)模虛擬篩選前，最好將不同蛋白靶點晶體結(jié)構(gòu)及不同精度對接打分對已知抑制劑進行驗證，從而挑選相對更合理的晶體結(jié)構(gòu)和打分方法。

圖2 2種不同MIF晶體結(jié)構(gòu)、3種不同Glide對接精度的實驗與計算活性線性相關(guān)圖Figure 2 The correlation of two different MIF crystal structures between the experimental log IC50and three docking scores

2.3 4K9G-HTVS 模式對典型ISO-1 類似物進行相互作用分析

通過“2.2”項的線性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4K9G-HTVS模式可以得到最佳的相關(guān)系數(shù)，所以基于4K9GHTVS模式得到的ISO-1類似物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分析比較文獻[30]報道的ISO-1 類似物（表1）中活性最強的化合物16 與最弱化合物9 的相互作用（圖3）。從圖中可以看出，化合物16 比化合物9 有更強的結(jié)合能力，原因可能是化合物16 中酚羥基與Asn97 的羰基氧原子可以形成更強的氫鍵，化合物16中的羰基和異噁唑環(huán)中氧原子可以與Lys32 的胺基形成2個氫鍵，另外化合物16中的環(huán)己烷基團可以與周圍的非極性氨基酸（Pro33、Ile64、Trp108、Phe113）等形成疏水相互作用，因此導(dǎo)致化合物16與MIF的結(jié)合更緊密。

圖3 4K9G-HTVS中化合物9、16的Glide對接構(gòu)象疊合圖（A）；4K9G-HTVS中MIF與化合物9（B）、16（C）的二維相互作用圖Figure 3 The superposition of two Glide docked compounds 9 and 16 (A);2D representation of the interactions between MIF and compounds 9,16(B,C)

2.4 高活性ISO-1類似物的理性設(shè)計與預(yù)測評價

通過以上的理論分析顯示，ISO-1 類似物要與MIF形成較強的相互作用，需要保留酚羥基、羰基等核心基團，有助于與Asn211、Ile64、Lys32 形成氫鍵相互作用。在此基礎(chǔ)上，對側(cè)鏈R進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈R如果被較大非極性基團取代（如化合物14、16），可以與Tyr36、Trp108 和Phe113 形成更強的疏水相互作用。此外，根據(jù)Cheng等［30］的報道，如果在酚羥基的鄰位引入鹵素原子（如氟原子），ISO-1 類似物活性可以增強約10倍，因此設(shè)計了6個新穎抑制劑分子（P1-P6），并且基于前面獲得的最優(yōu)4K9G-HTVS打分模式，對這些化合物進行打分驗證，結(jié)果顯示相比ISO-1，這些類似物與MIF 具有更強的結(jié)合親和力（表2）。另外，采用Schr?dinger 軟件包中Qikprop 成藥性預(yù)測軟件，預(yù)測了這些化合物的分子量、脂水分配系數(shù)和水溶性，盡管相比ISO-1 具有稍差的脂水分配系數(shù)和水溶性，但也在Qikprop 預(yù)測的合理成藥性范圍之內(nèi)。Qikprop 預(yù)測的具有成藥性化合物的合理相對分子質(zhì)量、脂水分配系數(shù)和水溶解度分別為130.0～725.0、-2.0～6.5和-6.5～0.5。

表2 理性設(shè)計的6個ISO-1類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及成藥性預(yù)測Table 2 Chemical structures，docking scores and properties predicted for ISO-1 and six designed compounds

3 結(jié)論

本文基于已知的MIF-ISO-1、MIF-ISO-66 晶體結(jié)構(gòu)，采用Glide 中3 種不同精度（HTVS、SP、ⅩP）對接打分方法，比較了不同晶體結(jié)構(gòu)、不同精度打分方法對ISO-1 類似物的結(jié)合模式和相互作用。通過比較對接打分與實驗活性的線性相關(guān)系數(shù)發(fā)現(xiàn)4K9G-HTVS模式可以獲得最佳的受體-配體結(jié)合親和力排序。接著采用4K9G-HTVS 模式，構(gòu)建了ISO-1 類似物中活性最弱的化合物9 與最強的化合物16 與MIF 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，通過分析發(fā)現(xiàn)，在R 側(cè)鏈中引入較大的非極性基團，可能與Pro33、Ile64、Trp108、Phe113 等形成疏水相互作用。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計了6 個新穎的ISO-1 類似物，并采用HTVS打分模式分別對接到4K9G 晶體結(jié)構(gòu)中MIF 結(jié)合口袋，理論預(yù)測發(fā)現(xiàn)，相比ISO-1，這些化合物具有更強的抑制活性。Qikprop 預(yù)測顯示這些化合物具有較好的成藥性。本文結(jié)果對于深入了解MIF 與配體的結(jié)合模式，理性設(shè)計具有更強活性和更好的成藥性的ISO-1衍生物提供了理論基礎(chǔ)。