β-欖香烯對(duì)肺炎克雷伯菌致急性肺炎大鼠的保護(hù)作用

夏耀宗 ，施紹瑞 ，胡偉 ，劉翔，付杰

（1.宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川宜賓 644000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400037）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一種革蘭陰性致病菌，可引起尿路感染、肺炎等多種感染，其中克雷伯菌引發(fā)的肺炎在免疫功能低下的患者中尤為嚴(yán)重，死亡率在25%～60%之間[1]。在細(xì)菌性肺炎模型中，病原體到達(dá)下呼吸道，繁殖引起肺泡毛細(xì)血管充血、水腫、肺泡纖維蛋白滲出、細(xì)胞浸潤(rùn)等炎性癥狀，產(chǎn)生大量炎癥因子，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)。β-欖香烯是從中藥莪術(shù)根莖中提取的一種非細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物，該化合物具有消炎和抗腫瘤特性，能夠通過(guò)血腦屏障。目前已報(bào)道β-欖香烯在體外和體內(nèi)具有多種生物活性，如抗腫瘤[2]、多重耐藥性[3]和免疫調(diào)節(jié)[4-5]作用，但其抗炎作用仍不清楚。因此，本研究擬通過(guò)克雷伯菌復(fù)制大鼠急性肺炎模型，探索β-欖香烯對(duì)克雷伯菌致急性肺炎大鼠外周血中肺組織炎癥因子及纖維化指標(biāo)的影響，及ERK1/2 和AKT 信號(hào)通路的參與情況，以期為急性肺炎臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45 只5～8 月 齡SPF 級(jí)健康成年雄性Sprague Dawleg（SD）大鼠，體質(zhì)量180～260 g，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCⅩK（川）2018-026，動(dòng)物使用的倫理審批號(hào)：LLPZ-016。

1.2 主要儀器

5430R高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Varioskan LUⅩ多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）；Eclipse 80i顯微鏡（日本尼康公司）；AMA440N 高壓滅菌鍋（英國(guó)Astell 公司）；ABI StepOnePlus TM 熒光定量PCR儀（美國(guó)基因儀器公司）。

1.3 藥品與試劑

β-欖香烯（江蘇菲亞生物科技有限公司）；阿奇霉素（蘇州俞氏藥業(yè)有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1一抗（BioVision CA 94043 USA）；山羊抗兔二抗（Proteintech）；Tris-base（Roche）；十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS，武漢尚寶生物科技）；蛋白Marker（Fermentas）；乙二胺四乙酸（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）緩沖液（pH 8.0，武漢百耐特化工有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；SYBR?Premix ExTaqTM（TliRNaseH Plus，日本Takara Bio 株式會(huì)社）；聚偏二氟乙烯膜（谷歌生物）；RIPA 強(qiáng)裂解液、ECL 發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 菌液配制

氣管內(nèi)接種前1天將肺炎克雷伯菌臨床株接種于血瓊脂平板上，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。比濁法用無(wú)菌生理鹽水稀釋成含菌量2.4×108CFU/mL的混懸液備用。

1.5 肺炎克雷伯桿菌肺炎大鼠模型的建立

大鼠按50～100 mg/kg 經(jīng)腹腔注射氯胺酮麻醉，頸部消毒、備皮后，無(wú)菌操作，暴露大鼠上段氣管，用1 mL注射器穿刺入氣管并滴入菌液。其中，模型組和各給藥組滴入0.15 mL濃度為2.4×108CFU/mL的菌液，正常組滴入相同劑量的生理鹽水。接種后立即豎立大鼠固定臺(tái)，使大鼠保持直立位約20 s，以保證接種菌液因重力作用而入肺。

1.6 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為6 組：健康對(duì)照組、肺炎模型組、β-欖香烯低劑量組、β-欖香烯中劑量組、β-欖香烯高劑量組和阿奇霉素組，每組各9 只。阿奇霉素組（45 mg/kg），β-欖香烯低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg），灌胃給藥12 周。健康對(duì)照組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMCNa）溶液。

1.7 方法

1.7.1 HE 染色 將各組大鼠肺組織置于4%（φ）多聚甲醛中固定72 h，隨后對(duì)已固定的肺組織置于20%（φ）乙二胺四乙酸中進(jìn)行脫鈣處理，將樣品在梯度濃度的乙醇中脫水并包埋在石蠟中。將石蠟包埋的組織切成5 μm切片，于室溫下進(jìn)行蘇木精染色10 min，隨后伊紅染色2 min。使用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.7.2 肺損傷評(píng)分和肺組織W/D 值檢測(cè) 收集肺組織用于檢測(cè)肺組織濕、干質(zhì)量及肺組織病理分析。病理分析按“1.7.1”項(xiàng)行HE 染色后觀察進(jìn)行病理結(jié)果評(píng)分。肺組織病理?yè)p傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1 級(jí)（0 分），肺泡壁完好無(wú)增厚，無(wú)炎性浸潤(rùn)，間質(zhì)無(wú)水腫，無(wú)充血；2級(jí)（1分），肺泡內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁未見(jiàn)增厚；3級(jí)（2分），明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)輕微水腫；4級(jí)（3分），明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)輕微水腫；5 級(jí)（4 分），嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)中度水腫；6 級(jí)（5 分），嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)重度水腫，纖維化物質(zhì)沉積，組織局灶性壞死，肺泡壁結(jié)構(gòu)不完整。參照肺炎癥程度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，在200 倍視野下，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分并計(jì)算總積分進(jìn)行分析。肺濕、干質(zhì)量的測(cè)定方法：剪下肺葉，用濾紙吸干，稱濕質(zhì)量后置80 ℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重，計(jì)算肺組織濕/干比（W/D）。

1.7.3 RT-PCR檢測(cè)凋亡標(biāo)記物Caspase-3,Caspase-9,Bax/Bcl-2,Survivin的基因表達(dá) 使用TRIzol 試劑提取總RNA，超微紫外光分光光度計(jì)測(cè)定吸光度（A260/A280）。按照Super RT cDNA 試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。通過(guò)Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct方法計(jì)算。用于該反應(yīng)的引物信息見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.7.4 ELISA 法測(cè)定外周血和肺組織中炎癥因子TNF-α和IL-10 的含量 取各組大鼠肺組織，滴入含有蛋白酶抑制劑的冰緩沖液，制作成勻漿液，離心收集上清液。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肺組織上清液TNF-α、IL-10 的含量，并用同樣的方法測(cè)定大鼠血清TNF-α、IL-10的含量。

1.7.5 Masson 染色 取出包埋處理的各組大鼠肺組織，進(jìn)行組織切片，二甲苯脫蠟，高濃度到低濃度酒精脫水，Masson膠原染色試劑染色，二甲苯浸泡5 min，封片后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7.6 Western blot 法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT 和p-AKT 蛋白表達(dá)量 各組大鼠肺組織勻漿加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量。SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。4 ℃下加 入Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT 和p-AKT 一抗（1∶1 000）孵育過(guò)夜，TBST 清洗后加入HRP-IgG（1∶10 000），加入電化學(xué)發(fā)光顯色液顯色。以β-actin 為內(nèi)參，ImageJ V1.8.0.112 軟件分析各組細(xì)胞目的蛋白與Actin比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-欖香烯對(duì)肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺組織病理的影響

肺組織形態(tài)變化見(jiàn)圖1。健康對(duì)照組肺臟層胸膜完整，結(jié)構(gòu)正常，無(wú)水腫，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及充血。與健康對(duì)照組比較，模型組肺臟間質(zhì)水腫嚴(yán)重，肺泡內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維素樣物質(zhì)沉積，組織局灶性壞死，肺泡壁明顯增厚；與模型組比較，阿奇霉素組有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)輕微水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整；與模型組比較，低劑量組肺泡內(nèi)含有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮細(xì)胞脫落，間質(zhì)水腫嚴(yán)重，中劑量組肺泡內(nèi)含大量炎性細(xì)胞，間質(zhì)輕度水腫，個(gè)別區(qū)域肺泡壁增厚，高劑量組肺泡少量炎性細(xì)胞，間質(zhì)輕度水腫。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Figure 1 Images of HE staining showed pathological morphological changes of the lung tissues in each group (HE staining,200×)

2.2 β-欖香烯對(duì)肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺損傷評(píng)分和W/D值的影響

如表2 所示，阿奇霉素組大鼠病理評(píng)分低于模型組（P＜0.05）。此外，與模型組比較，中、高劑量組大鼠病理評(píng)分均較低（P＜0.05）。與模型組比較，阿奇霉素組肺組織W/D 顯著降低（P＜0.05）；低劑量組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，中劑量組和高劑量組肺組織W/D 均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明β-欖香烯能減輕肺損傷，降低肺水腫。

表2 各組大鼠肺組織損傷評(píng)分和W/D值Table 2 Lung tissue injury scores and W/D values in each group

2.3 β-欖香烯對(duì)肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺組織凋亡的影響

如圖2所示，與健康對(duì)照組比較，模型組肺組織Bax/Bcl-2、caspase-9、caspase-3mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增高，SurvivinmRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，阿奇霉素組肺組織Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而肺組織SurvivinmRNA和蛋白表達(dá)卻顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組肺組織各基因的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中劑量組和高劑量組肺組織Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），而SurvivinmRNA和蛋白表達(dá)卻顯著升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織凋亡標(biāo)記物基因的表達(dá)Figure 2 Expression of apoptosis marker genes in each group

2.4 β-欖香烯對(duì)肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠炎癥因子的影響

如圖3所示，與健康對(duì)照組比較，模型組血清和肺組織中TNF-α、IL-10的含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，阿奇霉素組血清和肺組織中TNF-α含量顯著升高（P＜0.05），IL-10含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，中、高劑量組血清和肺組織中TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），IL-10含量顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠血清和肺組織中TNF-α和IL-10的含量Figure 3 The level of TNF-α and IL-10 in serum and lung tissues in each group

2.5 β-欖香烯對(duì)肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺纖維化的影響

各組大鼠進(jìn)行Masson 染色，如圖4 所示，健康對(duì)照組未觀察到明顯膠原沉積，肺泡間隔正常，結(jié)構(gòu)未見(jiàn)破壞。模型組可見(jiàn)膠原沉積增多，肺泡間隔增寬，結(jié)構(gòu)異常缺失，許多正常肺泡結(jié)構(gòu)為膠原纖維代替。低、中劑量組肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔基本與模型組相似，膠原纖維較健康對(duì)照組增多，但較模型組略有減少；病變程度和范圍均較模型組輕。高劑量組和阿奇霉素組肺泡結(jié)構(gòu)趨于完整、肺泡間隔正常，少見(jiàn)膠原沉積。

圖4 各組大鼠肺組織Masson染色病理學(xué)檢查結(jié)果（Masson染色，200×）Figure 4 Images of Masson staining showed pathological results of lung tissue in each group(Masson,200×)

如圖5 所示，從Western blot 結(jié)果中可以看出，阿奇霉素組、β-欖香烯中、高劑量組中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN 蛋白表達(dá)量較模型組降低。與健康對(duì)照組比較，模型組中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿奇霉素組、β-欖香烯中、高劑量組中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠肺纖維化標(biāo)記物蛋白表達(dá)Figure 5 Protein expression of pulmonary fibrosis markers in each group

2.5 β-欖香烯對(duì)ERK1/2和AKT磷酸化的影響

Western blot 檢測(cè)各組大鼠p-ERK1/2 和p-AKT水平，如圖6 所示，與健康對(duì)照組比較，模型組大鼠高表達(dá)p-ERK1/2 和p-AKT 蛋白。與模型組比較，β-欖香烯低劑量組p-ERK1/2 和p-AKT 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，β-欖香烯中、高劑量組和阿奇霉素組p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠ERK1/2和AKT的磷酸化情況Figure 6 Phosphorylation levels of ERK1/2 and AKT in each group

3 討論

肺炎是敗血癥最常見(jiàn)的病因，肺炎克雷伯菌是肺炎和敗血癥的常見(jiàn)病原體[6-7]。抗生素通常用于肺炎克雷伯菌感染的治療，其中碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是廣泛用作肺炎克雷伯菌引起的嚴(yán)重感染的首選藥物，尤其是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的菌株[8]。然而，由于克雷伯菌具有多重耐藥機(jī)制，目前治療方法的療效不斷下降，一些肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素具有高度耐藥性[9]。因此，探尋新的能夠治療肺炎克雷伯菌感染的高效、安全的藥物是臨床治療克雷伯菌急性肺炎的重要環(huán)節(jié)。

在細(xì)菌性肺炎模型中，肺組織產(chǎn)生大量炎癥因子，加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)。研究表明，β-欖香烯在多種炎性疾病和癌癥中發(fā)揮調(diào)控作用，如β-欖香烯通過(guò)下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)水平保護(hù)STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肺損傷，β-欖香烯通過(guò)降低細(xì)胞增殖、代謝和侵襲能力抑制多種癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯能明顯改善克雷伯菌急性肺炎大鼠肺組織病理?yè)p傷，降低肺組織的W/D 值，提示β-欖香烯可減輕肺炎克雷伯菌引起的肺損傷。

β-欖香烯可激活Caspase-3、7、9 和10，以及對(duì)Bcl-2 蛋白家族的影響引發(fā)凋亡性細(xì)胞死亡[13-14]。Zhang 等[15]報(bào)道稱，β-欖香烯可抑制Survivin表達(dá)以及Survivin與乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白相互作用蛋白之間的相互作用，研究還發(fā)現(xiàn)β-欖香烯在體外促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。而本研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯抑制Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2/Bax和Survivin的表達(dá)。這可能與β-欖香烯對(duì)不同疾病所起作用存在差異有關(guān)，其有待進(jìn)一步研究。

肺炎克雷伯菌感染可引起炎癥細(xì)胞流入肺實(shí)質(zhì)，并伴有促炎細(xì)胞因子和化學(xué)因子的釋放，造成中性粒細(xì)胞聚集[16-17]。Fang 等[18]發(fā)現(xiàn)在RAW264.7 巨噬細(xì)胞系中β-欖香烯能明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的促炎性介質(zhì)，包括IL-6、TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。此外，β-欖香烯抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞中iNOS 和IL-10 的表達(dá)，β-欖香烯的抗炎作用與其對(duì)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯能抑制外周血和肺組織中的TNFα水平，提高IL-10 水平。TNF-α可以通過(guò)T 細(xì)胞促進(jìn)各種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。抗炎性細(xì)胞因子IL-10 抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，增強(qiáng)抗炎性因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果表明β-欖香烯針對(duì)克雷伯菌急性肺炎具有潛在的抗炎作用。

在肺纖維化中，正常的肺組織結(jié)構(gòu)被瘢痕組織所取代，瘢痕組織通常以膠原沉積和成纖維細(xì)胞增殖為特征。本研究采用Masson 染色發(fā)現(xiàn)β-欖香烯使成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，肺間質(zhì)區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積得以緩解。TGF-β1 是主要的促纖維化細(xì)胞因子之一，在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。而在肺纖維化過(guò)程中，成纖維細(xì)胞被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其中α-SMA 表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)ECM 蛋白沉積，被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物[19]。本研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯可顯著降低TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN 蛋白表達(dá)水平，表明β-欖香烯可以減輕肺纖維化。

肺纖維化與細(xì)胞因子和激酶激活肺組織纖維化信號(hào)通路有關(guān)，其中ERK1/2 是細(xì)胞表面到細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要遞質(zhì)。ERK1/2 是成纖維細(xì)胞增殖和分化信號(hào)傳導(dǎo)的共同途徑，也是成纖維細(xì)胞向核內(nèi)多次信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同途徑。ERK1/2/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)通路在肺纖維化中細(xì)胞增殖、分化、新陳代謝及凋亡過(guò)程中有著重要作用，ERK1/2/AKT 蛋白過(guò)表達(dá)，促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化生物學(xué)行為[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)β-欖香烯顯著降低ERK1/2 和AKT的磷酸化水平，表明β-欖香烯可能通過(guò)ERK1/2 和AKT 信號(hào)通路抑制肺成纖維細(xì)胞分化。

綜上所述，本研究通過(guò)克雷伯菌建立大鼠急性肺炎模型，觀察到β-欖香烯能抑制ERK1/2 和AKT的磷酸化，表明β-欖香烯對(duì)克雷伯菌急性肺炎具有抗炎作用，能降低炎癥因子水平，使肺纖維化程度得以減輕，為β-欖香烯應(yīng)用于急性肺炎的臨床防治提供了理論依據(jù)。