基于網絡藥理學分析青蒿素治療炎癥性腸病的靶點及機制

雷玉婷 ，楊艷紅，雷自立

[1.廣東藥科大學中醫藥研究院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學附屬第一醫院（臨床醫學院），廣東廣州510080]

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種病因不明的慢性胃腸道炎癥性疾病，主要分為克羅恩病（inflammatory bowel disease，CD）和潰瘍性結腸炎（inflammatory bowel disease，UC）2類[1]。近年來，隨著現代人的飲食和生活習慣的改變，IBD的發病率和患病率迅速增加，由IBD 引起的醫療費用也給社會和經濟發展帶來了巨大負擔[1-3]。用于治療IBD 的傳統藥物包括磺胺嘧啶、5-氨基水楊酸制劑、糖皮質激素和免疫抑制劑等[1]。抗腫瘤壞死因子（TNF）單克隆抗體和抗整合素，以及新開發的白介素（IL）-12 和IL-23 的抗p40 亞基也已被批準用于治療IBD[4-6]。這些藥物可以控制炎癥并促進腸黏膜的愈合，但具有一些副作用，例如肝腎毒性，并且仍無法長期緩解[1，6]。天然化合物具有多種生物和醫學活性，其有效性、高安全性、低毒性和可利用性吸引了越來越多的關注[7]。

青蒿素（artemisinin，分子式為C15H22O5）是一種倍半萜內酯分子，含過氧基團，有研究表明青蒿素及其衍生物在治療IBD 及結腸癌等方面有積極作用[8-9]。本實驗室前期工作研究表明，雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）可明顯減輕葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導的IBD小鼠模型腹瀉和便血情況，顯著降低IBD 小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-23 水平，下調TNF-α、IL1β和IL-6在小鼠腸道的表達水平。此外，DHA 可改善IBD 小鼠腸道炎癥細胞的浸潤，上調小鼠結腸EpCAM、Claudin-1、Claudin-2、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-7的表達水平，通過修復腸道緊密連接以及調控腸道菌群改善IBD[10]。

傳統中藥具有多成分、多靶點的作用特點，研究其治病機制比較困難[11]。IBD 患者呈現出多種多樣的病理特征，有各種先天性和適應性免疫效應子參與，這種異質性導致各種動物模型上的研究還是有缺陷的[12]。因此，應用人類生物數據庫進行研究很有必要。網絡藥理學是基于系統生物學，通過生物網絡分析技術，查找相關數據庫、利用多種信息化分析工具和方法來構建各種生物、基因之間的關系網絡圖，借此系統地闡述“基因-靶點-疾病-藥物”之間復雜關系的一門新興網絡交叉學科[13]。本研究使用該方法，預測青蒿素對IBD 治療的活性成分、潛在作用靶點及作用機制，旨在為青蒿素在IBD 的潛在臨床應用和深入研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（大連美侖生物技術有限公司）；羧甲基纖維素鈉（天津致遠化學試劑有限公司）；雙氫青蒿素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Trizol（Invitrogen 公司）；反轉錄試劑盒（日本Takara 公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；PikoReal 96型Real-time PCR儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.1.2 實驗動物 7周齡雌性SPF級C57BL/6小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體質量20～23 g，實驗動物合格證號43004700064578，在廣東藥科大學動物中心飼養，室溫25 ℃，12 h/12 h晝夜間斷光照。

1.2 方法

1.2.1 青蒿素靶點收集 以“artemisinin（青蒿素）”為關鍵詞在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺數據庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集數據，并按一定條件篩選青蒿成分，同時搜索Pubchem等其他數據庫作為補充，將獲得的Canonical SMILES 導 入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、Drugbank 數據庫（https：//www.Drugbank.ca/）、PharmMapper（http：//lilab.ecust.edu.cn/phanmmapper/index.php），獲得青蒿素靶點[13]。

1.2.2 IBD 的靶點信息收集 通過查找TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Dru-gbank數據庫（https：//www.Drugbank.ca/）、DisGeNET 數據庫（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）中與IBD相關的靶點基因，將收集到的有關靶點基因信息全部導入Uniprot 數據庫（http：//www.Uniprot.org/），并對多個疾病數據庫收集到的結果進行整合[14]。

1.2.3 青蒿素與IBD 共同靶點收集 將收集到的青蒿素靶點和IBD 靶點制作成韋恩圖，兩圖交集區域即為共同靶點，是青蒿素對IBD的作用靶點。

1.2.4 構建蛋白相互作用網絡 運用STRING 數據庫將篩選出的直接作用靶點進行蛋白相互作用，獲得蛋白相互作用網絡，導出相關文件并分析，篩選出關鍵靶點。

1.2.5 生物學功能和通路分析 將青蒿素與IBD 共同靶點導入ClueGO 和DAVID 6.8 數據庫（https：//david.Ncifcrf.gov/），物種選擇人類（Homo sapiens，Human），進行GO（Gene Ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析。利用ImageGP 工具（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）繪制青蒿素和IBD 共同靶點的前20 條生物學過程分析氣泡圖、細胞組分氣泡圖、分子功能氣泡圖以及KEGG通路氣泡圖[15]。

1.2.6 炎癥性腸病小鼠模型的建立 將7 周齡的C57BL/6 雄性小鼠放置于SPF 級動物實驗室喂養，并隨機分為3 組：對照組、DSS 組和DHA 組。其中DSS 組和DHA 組小鼠自由飲用4%（質量濃度，下同）的DSS 水，對照組自由引用純凈水。第7 天時，DSS 組和DHA 組小鼠停止飲用4%的DSS 水，改為飲用與對照組一樣的純凈水。第12天時，DSS 組和DHA 組繼續自由飲用2%濃度的DSS 水，對照組繼續自由飲用純凈水，同時對照組和DSS組用0.5%羧甲基纖維素鈉每日灌胃1 次，DHA 組則用混懸于羧甲基纖維素鈉的0.5%雙氫青蒿素每日灌胃1 次，劑量為150 mg/kg。第18 天麻醉處死小鼠，取出結腸等組織進行后續實驗。

1.2.7 組織RNA 提取和Real-time PCR 使用TRIzol?reagent 試劑盒提取小鼠結腸組織的總RNA，并使用PrimeScriptTM RT Reagent kit 試劑盒去除基因組DNA 和逆轉錄。E-cardherin 引物序列為：E-cardherin-F，GGTCTCTTGTCCCTTCCACA；E-cardherin-R，CCTGACCCACACCAAAGTCT。使用PikoReal PCR 系統進行Real-time PCR，反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，65 ℃15 s，40個循環，GAPDH作為內參基因。

1.2.8 16S rDNA 基因分析及數據處理 糞便細菌DNA提取和16S rDNA基因測序分析由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。從樣本中提取基因組DNA 后，用特異引物擴增16S rDNA 的V3+V4 區，引物序列為：341F，CCTACGGGNGGCWGCAG；806R，GGACTACHVGGGTATCTAAT。將純化回收后的擴增產物連接測序接頭，構建測序文庫，上機測序。利用quantitative insights into microbial ecology（QIIME，version1.9.1）進行數據分析，將得到的Raw reads 進行過濾，得到Clean Tag，接下來對Clean Tag 進行聚類，得到的數據為Effective Tag。將這些基因序列用Uparse（version 9.2.64_i86linux32）進行比對，得到OUT（operational taxonomic units），隨后使用Ribosomal database project classifier（version 2.2）對這些數據進行物種組成分析。使用Ace 和chao的方法計算細菌的豐度，使用Shannon和Simpson的方法計算細菌的多樣性，使用KEGG 對菌群進行功能富集分析。

1.2.9 統計學方法 采用軟件IBM SPSS Statistics 24.0 和graphpad Prism 7 進行統計分析，3 組樣本采用單因素ANOVA 方法，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 青蒿素靶點的篩選

在Pubchem 數據庫中獲得青蒿素的Canonical SMILES：CC1CCC2C（C（=O）OC3C24C1CCC（O3）（OO4）C）C，用得到的Canonical SMILES 在Swiss Target Prediction、Drugbank 數據庫、Pharm Mapper等多個數據庫中搜索獲得青蒿素相關靶點，其中Swiss Target Prediction數據庫252個、Drugbank數據庫3個、Pharm Mapper數據庫100個，導入Uniprot數據庫進行基因標準化、去掉重復值，最終得到341個青蒿素靶點。其中包括細胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，CYP1A2）、脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）、Toll 樣受體9（toll-like receptor 9，TLR9）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1（recombinant protein tyrosine phosphatase，PTPN1）、毒蕈堿型膽堿受體（M1 recombinant cholinergic receptor，Muscarinic 1，CHRM1）等。

2.2 IBD靶點信息收集和篩選

以“inflammation bowel disease”為關鍵詞，選擇homo spanies 作為物種，在疾病相關數據庫中搜索IBD 的靶點基因，其中TTD 數據庫57 個、isGeNET數據庫1 577個、Drugbank數據庫11個，將靶點基因導入Uniprot數據庫進行基因標準化后歸納整理，合并去掉重復基因，共得到1 629 個疾病基因，包括腫瘤壞死因子（TNF）、白介素10（IL-10）、白介素23（IL-23）、HPS1 溶酶體細胞器復合物3（HPS1 biogenesis of lysosomal organelles complex 3 subunit 1）、白介素6（IL-6）、Toll 樣受體9（toll-like receptor 9，TLR9）、細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM1）、趨化因子2（chemokine 2，CCL2）等。

2.3 青蒿素治療IBD的靶點收集

將青蒿素靶點和IBD 靶點取交集繪制成韋恩圖（見圖1），得到青蒿素和IBD的共同靶點有84個。將共同靶點導入STRING 數據庫，構建共同靶點間相互作用關系，其中置信度得分排名前20的蛋白相互作用見表1，以JAK2、AKT、ⅩIAP、MAPK、EFGR及STAT1 等蛋白相互作用置信度得分較高，這些基因主要集中在幾條重要的信號通路上，涉及腸道炎癥反應、細胞的生長、增殖和分化、細胞之間信號傳導及轉錄激活等方面，說明了這些靶點在青蒿素治療IBD過程中起主導作用。

表1 置信度得分排名前20的青蒿素和IBD共同靶點蛋白相互作用關系Table 1 Common target protein interaction between artemisinin and IBD with top 20 confidence score

圖1 青蒿素IBD交集靶點Venn圖Figure 1 Venn diagram of artemisinin and IBD

2.4 生物學功能和通路分析

2.4.1 GO 分析 將青蒿素和IBD 的84 個共同靶點導入ClueGO 分析，物種選擇Homo sapiens（Human），獲得富集網絡分析結果，其中GO-terms 為94個，GO-terms關系115條，總體統計之后做餅狀圖分析，見圖2。可見大部分GO-terms富集在調節分泌、平滑肌細胞增殖、細胞因子的產生與免疫反應等過程中。將青蒿素和IBD 的84 個共同靶點導入DAVID 6.8 數據庫，物種選擇Homo sapiens（Human），GO 分析共獲得288 條富集結果，其中189 個生物學過程分析、31個細胞組分、68個分子功能，主要涉及到細胞連接、信號傳導、凋亡過程的負調控、先天免疫反應、MAPK 級聯、嗜酸性粒細胞趨化性、革蘭陰性菌的防御反應、寄主共生體生長的負調控、單核巨噬細胞趨化性、氧氣輸送及免疫應答等方面。

圖2 青蒿素與IBD靶點的富集網絡餅狀圖Figure 2 Pie chart of enrichment network of the targets of artemisinin and IBD

2.4.2 KEGG 分析 將青蒿素和IBD 的84 個共同靶點導入DAVID 6.8 數據庫，物種選擇Homo sapiens（Human），得到72 條KEGG 通路，其中有多條通路與青蒿素治療IBD 緊密相關，其中包括一些與細胞黏附連接有關的信號通路，如黏著斑（focal adhesion）信號通路和黏附連接（adherens junction）信號通路等，還包括大量與炎癥反應密切相關的信號通路，如趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）、T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）和NOD 樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、癌癥通路（proteoglycans in cancer、pathways in cancer）、Rap1 信號通路（rap1 signaling pathway）、結腸癌（colorectal cancer）、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導（epithelial cell signaling in helicobacter pylori infection）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，見表2。利用imageGP 工具繪制青蒿素IBD 信號通路氣泡圖，見圖3。最后將共同靶點導入Cytoscape中繪制“藥物-疾病-靶點-通路圖”，見圖4。

圖3 青蒿素治療IBD的KEGG通路氣泡圖Figure 3 Bubble diagram of KEGG pathway in IBD of artemisinin treatment

圖4 青蒿素與IBD的藥物—疾病—靶點—通路網絡互作圖Figure 4 Interaction network of drug-disease-target-pathway of artemisinin and IBD

表2 青蒿素和IBD的共同靶點富集的重要KECG信號通路Table 2 Important KECG signaling pathways enriched by common targets of artemisinin and IBD

2.5 相關實驗驗證及分析

以上部分相關信號通路已經在本課題組前期的研究中得到了實驗數據支持[9]。實驗結果表明，與對照組相比，DSS 誘導的炎癥性腸病小鼠腸道組織中黏附連接因子E-cardherin 表達水平顯著降低，用青蒿素衍生物雙氫青蒿素（DHA）處理后，結腸上黏附連接因子E-cardherin有恢復上調的趨勢，見圖5。腸道菌群測序結果顯示Bacteroidales_S24-7_group 在所有菌群豐度中占很大的比重，同時在門水平上，與對照組小鼠相比，DSS 組的Bacteroidales_S24-7_group豐度顯著降低，而給予DHA處理后，豐度明顯升高，見圖6。圖7 為3 組小鼠腸道菌群功能豐度熱圖。

圖5 E-cardherin在炎癥性腸病小鼠結腸組織中的表達水平Figure 5 Expression of E-cardherin in the colon of mice with inflammatory bowel disease

圖6 腸道菌群豐度分析Figure 6 Analysis of intestinal flora abundance

圖7 炎癥性腸病小鼠腸道菌群功能豐度熱圖Figure 7 Thermogram of functional abundance of the gut microbiota of the IBD mice

3 討論

本次研究中共收集獲得IBD 靶點1 629 個，青蒿素有效成分靶點341 個。其中，包含了84 個共同靶點，在這之中相互作用置信度得分比較高的靶點包括非受體型酪氨酸蛋白激酶家族（Janus kinase family，JAK family）、信號轉導和轉錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT Serine/Threonine Kinase 1，AKT1）和絲裂原激活的蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）等。對青蒿素治療IBD 的共同靶點進行GO 富集分析后，結果提示青蒿素可以通過調控多種生物學過程和分子功能來干涉和改善腸道炎癥，主要集中在positive regulation of secretion（分泌的正向調節）、regulation of smooth muscle cell proliferation（平滑肌細胞增殖的調節）、cytokine production involved in immune response（免疫反應中的細胞因子產生）等GO過程。這些GO過程提示了青蒿素不僅能調節免疫細胞因子的產生、改善腸道炎癥，還可能從正向調節分泌和增殖腸道平滑肌2個方向修復腸道屏障。在本課題組前期的研究中確實發現了雙氫青蒿素對腸道炎癥的改善作用和對腸上皮連接細胞緊密連接蛋白的上調作用[10]，但目前還沒有實驗研究結果可以完全闡述其中的作用機制，還需要進一步的探索。同時KEGG 分析結果可看出青蒿素在抗菌和預防結腸癌癥相關通路上也起到積極作用，如一些基因富集在Colorectal cancer（結腸癌）、Epithelial cell signaling inHelicobacter pyloriinfection（幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號傳導）等相關通路上。另外因炎癥因子生成和清除之間出現失衡而引發的機體損傷的積累效應可顯著影響到肝臟、脾臟、骨骼肌等組織器官，這些常見的生物過程均在本研究中得到了富集，初步證實了青蒿素可通過調節多種分子、代謝過程分子功能來促進機體改善IBD癥狀并預防結腸癌的發生。

本研究對P≤0.01 的信號通路進行篩選，獲得多條主要信號通路，其中與青蒿素治療IBD 緊密相關的通路主要集中在focal adhesion（黏著斑連接）和adherens junction（黏著連接）、chemokine signaling pathway（趨化因子信號通路）、T cell receptor signaling pathway（T 細胞信號通路）和NOD-like receptor signaling pathway（NOD 樣受體信號通路）等。腸上皮屏障功能受損一直都被認為是炎癥性腸病（IBD）的病理機制之一，腸屏障可以保護腸細胞免受病原微生物的侵害，腸屏障的損傷會改變腸道微生物群的組成、腸道的免疫系統和代謝，進而導致炎癥性腸病甚至腸道癌癥的發生。腸上皮屏障由各種細胞連接組成，其中黏著斑連接和黏附連接也是這些細胞連接的重要組成部分，它們對腸上皮細胞之間的連接起著關鍵作用。從本文的分析結果來看，青蒿素治療IBD 的靶點在這2個重要的細胞連接通路上的富集也證明了青蒿素在修復細胞連接上有很好的效果，前期的動物實驗研究也證明了DHA在對炎癥性腸病小鼠的腸道上皮緊密連接方面有很顯著的修復作用[9]，但目前對于青蒿素修復上皮細胞連接的研究還很少，其具體的作用機制還需進一步探索。

本研究中得到的一些重要的信號通路已經在本課題組前期研究中得到了實驗驗證，例如DSS誘導的炎癥性腸病小鼠腸道組織中黏附連接因子E-cardherin 表達水平顯著降低，用DHA 處理后E-cardherin 有恢復上調的趨勢，另外前期工作表明還有一些緊密連接因子，例如EpCAM、Claudin-2、Claudin-3、Claudin-7 的表達也得到了明顯的恢復[10]。同時，炎癥性腸病小鼠腸道菌群中擬桿菌科Bacteroidales_S24-7_group 的豐度顯著降低，據相關文獻報道，擬桿菌科Bacteroidales_S24-7_group的豐度與發生炎癥的程度成反比[15]。在門水平上，與對照組小鼠相比，DSS 組的Bacteroidales_S24-7_group豐度顯著降低，而給予DHA 處理后，Bacteroidales_S24-7_group 豐度明顯升高。也就是說，DHA 能顯著改善IBD 小鼠的菌群失調，增加有益菌的豐度，發揮治療作用。這些菌群的功能分析顯示DHA組菌群在cell motility 通路上顯著富集，可見DHA在恢復腸上皮細胞連接的同時激活了細胞的運動能力，這與用網絡藥理學預測的DHA影響黏著斑信號通路的預測一致。黏著斑信號在細胞運動上起著很重要的作用，一般在炎癥潰瘍傷口愈合期間，細胞的黏著斑信號及黏附連接極大地影響了細胞的遷移活動，促進了傷口的愈合[16]，菌群功能分析可看出DHA 對細胞連接的改善也體現在了細胞的遷移能力上。

通過網絡藥理學的分析，本研究發現青蒿素不僅在多個靶點和多種信號通路發揮抗炎的作用，并且能夠恢復腸上皮細胞連接蛋白的水平，作用于多個通路靶點修復腸道屏障，這些特點都預示著青蒿素在治療炎癥性腸病的過程中可能會有意想不到的療效。因此，利用網絡藥理學分析平臺預測青蒿素靶點及IBD靶點對青蒿素治療IBD機制的研究具有重要意義，為今后的實驗研究指明方向，并對青蒿素治療IBD的研究具有指導意義。