張氏消腫定痛膏透皮吸收物質基礎研究

徐長瓊 ，李然 ，任秋蕓 ，梅君 ，黎珊 ，黃會保，夏麗瓊

（1.岳陽市婦幼保健院科研所，湖南岳陽 414000；2.汕頭大學醫學院，廣東汕頭 515000；3.岳陽市中醫醫院藥劑科，湖南岳陽 414000）

“岳陽張氏正骨術”由張瑞林創立，歷經百余年理論發展及實踐驗證，成為湖湘中醫正骨的主流學派，2012 年被國家中醫藥管理局確定為第一批全國十三大骨傷學術流派傳承工作室建設項目，2017 年獲評“湖南省非物質文化遺產代表性項目”[1-4]。

“岳陽張氏正骨術”提倡內外相合用藥，百余年來積累了多種有效秘方，自擬自制過張氏消腫定痛膏、接骨止痛膠囊等10 余種院內制劑，用于治療急慢性軟組織損傷，臨床療效顯著，安全性良好。然而，張氏消腫定痛膏治療骨傷科疾病的物質基礎研究及其外用透皮吸收物質基礎研究均未見文獻報道，本項目擬使用大鼠離體皮膚，制備張氏消腫定痛膏透皮滲透液，通過UPLC-MS/MS和自建數據庫等廣泛靶向代謝組學研究平臺，研究張氏消腫定痛膏透皮吸收物質基礎，了解藥物透皮吸收成分及相對含量，明確張氏消腫定痛膏發揮藥效作用的物質基礎。

1 儀器與試劑

超高效液相色譜（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）；串聯質譜（Applied Biosystems 6500 QTRAP）；BSA224S-CW 型電子分析天平[（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；ⅩMTD-7000 磁力攪拌器（天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠）；甲醇、乙腈、乙醇為Merck 色譜純試劑；標準品（BioBio-Pha/Sigma-Aldrich）；張氏消腫定痛膏由岳陽市中醫院骨傷科提供。

2 方法

2.1 供試品的制備

張氏消腫定痛膏原藥提取物的制備：取各張氏消腫定痛膏原藥0.5 g，置15 mL 離心管中，加甲醇10 mL，超聲提取1 h，加甲醇至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

張氏消腫定痛膏透皮成分的制備：健康SD 大鼠處死后剃毛，剝離大鼠背部皮膚，剔除皮下脂肪以及粘連物，剪成適當大小，-20 ℃保存；用時解凍，生理鹽水浸潤，自制滲透池，角質層面敷貼張氏消腫定痛膏，真皮層面向接受室，接受池中加10 mL預熱生理鹽水，37 ℃恒溫攪拌，每隔2 h從接受池吸取滲透液后再補加預熱生理鹽水，重復以上步驟至12 h，即得透皮滲透液（制備過程見圖1）。待測液高速離心后取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，UPLCMS/MS測定主要成分含量。空白組不加藥，用以排除大鼠皮膚及裝置物質干擾。

圖1 張氏消腫定痛膏透皮滲透液的制備Figure 1 Preparation of osmotic solution of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

2.2 測定條件

液相條件：色譜柱為Agilent SBC18柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；以超純水（加入0.1%的甲酸）為流動相A相，乙腈為B相，洗脫梯度（0.00 min，5%B；9.00 min 內，95%B，維持1 min；10.00～11.10 min，5%B；并以5%平衡至14 min）；流速為0.35 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V，簾氣（curtain gas,CUR）206.85 kPa，碰撞誘導電離（collision-activated dissociation,CAD）參數設置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個離子對是根據優化的去簇電壓（declustering potential,DP）和碰撞能（collision energy,CE）進行掃描檢測。

2.3 定性定量分析方法

2.3.1 定性分析 基于自建數據庫MWDB（metware database），根據二級譜信息進行定性，分析時去除同位素信號，含K+離子、Na+離子、NH4+離子的重復信號，以及本身是其他更大分子量物質的碎片離子的重復信號。

2.3.2 定量分析 利用三重四級桿質譜的多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析完成。MRM 模式中，四級桿首先篩選目標物質的前體離子（母離子），排除其他分子量物質對應的離子以初步排除干擾；前體離子經碰撞室誘導電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標離子干擾。獲得不同樣本的質譜分析數據后，用MultiaQuant軟件打開樣本下機質譜文件，進行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積（Area）代表對應物質的相對含量，并對其中同一化合物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正。

2.4 樣本質控分析

質控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復性。在儀器分析的過程中，每10 個檢測分析樣本中插入1 個質控樣本，以監測分析過程的重復性。

2.5 數據處理

分類比較透皮吸收物質總數量；將所有檢測到的化合物總峰面積相加為100%，然后將每個成分單獨色譜峰峰面積/總峰面積，得該峰所對應化合物相對質量分數（%），根據相對質量分數值比較每一類化合物總質量分數和該類化合物分布；每類物質列出相對質量分數大于0.01%或最高的20種化合物。

3 結果

3.1 數據結果評估

利用軟件Analyst 1.6.3 處理質譜數據。圖2 為樣品、混樣質控QC 樣本的總離子流圖（Total ions current，TIC）及MRM 代謝物檢測多峰圖（多物質提取的離子流譜圖，ⅩIC）。通過對不同質控QC 樣本質譜檢測分析的總離子流圖進行重疊展示分析，可見代謝物提取和檢測重復性、儀器穩定性良好，數據可靠。

圖2 張氏消腫定痛膏UPLC-MS/MS離子流圖Figure 2 UPLC-MS/MS ion flow map of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

3.2 張氏消腫定痛膏及其滲透液中的化學成分

張氏消腫定痛膏中總共檢測到542 種化合物（圖3，ZSZG），其中黃酮類化合物122 種，酚酸77種，氨基酸及其衍生物42 種，萜類40 種，木脂素和香豆素40 種，有機酸34 種，生物堿33 種，核苷酸及衍生物26 種，脂質25 種，醌類12 種，鞣酸9 種，維生素8種，糖及醇類5種，其他69種。

張氏消腫定痛膏滲透液中總共檢測到422種化合物（圖3，ZSZG-D），其中酚酸71種，黃酮類化合物75 種，萜類37 種，木脂素和香豆素38 種，有機酸31種，生物堿27 種，氨基酸及其衍生物28 種，醌類10種，核苷酸及衍生物16 種，脂質12 種，鞣酸6 種，其他71種。

圖3 張氏消腫定痛膏（ZSZG）及透皮滲透液（ZSZG-D）中化合物分類及數量Figure 3 Classification and quantity of compounds in Zhang's antiswelling (ZSZG) and relieving pain ointment and dialysate(ZSZG-D)

3.3 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物的相對質量分數

將同類物質相對百分比相加，計算該類化合物總質量分數（圖4），其中生物堿占（6.33±2.10）%，酚酸占（37.83±9.23）%，有機酸占（7.91±2.22）%，黃酮占（5.61±0.60）%，萜類占（3.20±0.92）%，木脂素和香豆素占（3.31±1.03）%，氨基酸及衍生物占（9.99±1.20）%，醌類占（2.05±0.91）%，核苷酸及衍生物占（7.78±1.29）%，脂質占（3.48±0.10）%，鞣酸占（0.13±0.09）%，其他化合物占（12.39±2.91）%。

圖4 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物分類及總相對質量分數Figure 4 Classification and total relative content of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

將同類物質相對質量分數進行統計（圖5），其中酚酸平均質量分數較高，但各成分的質量分數差異較大，最高的化合物為綠原酸*（*代表同分異構體，下同）。

圖5 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物分類及質量分數分布Figure 5 Classification and content distribution of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

3.4 張氏消腫定痛膏的主要透皮成分

將每類物質相對質量分數進行排序，選取相對質量分數較高的20 種或大于0.01%的化合物列表。可見氨基酸及其衍生物、酚酸、黃酮、木脂素和香豆素、生物堿、萜類、有機酸、核苷酸及其衍生物、脂質、醌類和鞣質中，質量分數最高的化合物依次為L-精氨酸（表1）、綠原酸*（表2）、6-羥基山柰酚-3，6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸（表3）、5-甲氧基-8-羥基補骨脂素（表4）、去甲麻黃堿（表5）、獐牙菜苷（表6）、氨基丙二酸（表7）、N6-琥珀酰腺苷（表8）、十六烷基鞘胺醇（表9）、大黃酸-8-O-（6′-O-乙酰基）-葡萄糖（表10）和沒食子酸（表11），其他化合物中羥基紅花黃色素A質量分數最高（表12）。

表1 張氏消腫定痛膏滲透液中主要氨基酸及其衍生物（前20種）Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表1 張氏消腫定痛膏滲透液中主要氨基酸及其衍生物（前20種）Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表2 張氏消腫定痛膏滲透液中主要酚酸類物質（前20種）Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表2 張氏消腫定痛膏滲透液中主要酚酸類物質（前20種）Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表3 張氏消腫定痛膏滲透液主要黃酮類物質（前20種）Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表3 張氏消腫定痛膏滲透液主要黃酮類物質（前20種）Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表4 張氏消腫定痛膏滲透液中主要木脂素和香豆素（前20種）Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表4 張氏消腫定痛膏滲透液中主要木脂素和香豆素（前20種）Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表5 張氏消腫定痛膏滲透液中主要生物堿（前20種）Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表5 張氏消腫定痛膏滲透液中主要生物堿（前20種）Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表6 張氏消腫定痛膏滲透液中主要萜類化合物（前20種）Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表6 張氏消腫定痛膏滲透液中主要萜類化合物（前20種）Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表7 張氏消腫定痛膏滲透液中主要有機酸（前20種）Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表7 張氏消腫定痛膏滲透液中主要有機酸（前20種）Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表8 張氏消腫定痛膏滲透液中主要核苷酸及衍生物（＞0.01%）Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表8 張氏消腫定痛膏滲透液中主要核苷酸及衍生物（＞0.01%）Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表9 張氏消腫定痛膏滲透液中主要脂質（＞0.01%）Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表9 張氏消腫定痛膏滲透液中主要脂質（＞0.01%）Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表10 張氏消腫定痛膏滲透液中主要醌類物質（＞0.01%）Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表10 張氏消腫定痛膏滲透液中主要醌類物質（＞0.01%）Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表11 張氏消腫定痛膏滲透液中主要鞣質（＞0.01%）Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表11 張氏消腫定痛膏滲透液中主要鞣質（＞0.01%）Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表12 張氏消腫定痛膏滲透液中其他主要物質（前20種）Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表12 張氏消腫定痛膏滲透液中其他主要物質（前20種）Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

4 討論

張氏消腫定痛膏是張氏正骨學術流派傳承人在中醫理論及張氏正骨學術思想指導下研制而成，由骨碎補、當歸、紅花、川芎、續斷、龍血竭、王不留行、梔子、大黃等25味中藥制成，在岳陽市中醫醫院及張氏正骨學術流派工作室臨床工作中，歷經20余年數萬例的臨床驗證，具有行氣、活血化瘀、消腫止痛的功效，對損傷軟組織無菌性炎癥的改變、局部急性炎癥的修復具有重要促進作用[1-4]。

本研究結果顯示，張氏消腫定痛膏中總共檢測到542種化合物，其中黃酮類化合物和酚酸最多，分別為122 種和77 種。張氏消腫定痛膏滲透液中檢測到422 種化合物，其中最多的是酚酸71 種，黃酮類化合物75 種，萜類37 種；相對質量分數最高的依次為酚酸[（37.83±9.23）%]、氨基酸及衍生物[（9.99±1.20）%]、有機酸[（7.91±2.22）%]。可見酚酸類物質透皮吸收良好，酚酸具有重要的抗炎[5]和治療神經肌肉相關疾病[6]作用，與張氏消腫定痛膏適應證較一致。

張氏消腫定痛膏滲透液中化合物相對質量分數超過1.00%的分別為綠原酸*、十六烷基鞘胺醇、L-精氨酸、N6-琥珀酰腺苷、脯氨酸甜菜堿、羥基紅花黃色素A*、N-乙酰-L-谷氨酸、黃嘌呤、大黃酸-8-O-（6′-O-乙酰基）-葡萄糖、哌啶酸、D-（+）-蔗糖、鄰苯二甲酸二丁酯*、新綠原酸*、3，4-二羥基苯甲醛、6-羥基山柰酚-3，6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸、氨基丙二酸、4-胍基丁酸、異戊烯基腺苷-7-葡糖苷、2-羥基-3-丁烯基硫苷和去甲麻黃堿，其中綠原酸的質量分數最高，它具有抗炎[7-8]、抗氧化[9]等活性作用。透皮吸收化合物主要來源于續斷[10-11]、紅花[12-13]、大黃[14-15]、川芎[16-17]、枳實[18]和骨碎補[19]等中藥材，與張氏消腫定痛膏處方較一致。

本文結果表明，基于UPLC-MS/MS和自建數據庫等廣泛靶向代謝組研究平臺對于復雜的中藥復方物質基礎研究具有簡便、高效的特點，但因儀器分辨率限制，定性分析準確性存在一定爭議；另外，由于不同化合物在質譜中響應存在差異，導致使用峰面積進行相對定量分析具有一定誤差。但本研究對張氏消腫定痛膏透皮吸收化合物具有初步篩選的作用，對后續提高制劑療效和質量控制具有一定的指導意義。