基于PI3K/AKT/GSK-3β 信號(hào)通路探討白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠的作用

胡旭中，黃宜鋒，張偉

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518109）

膽汁淤積癥是一種由于膽汁形成或分泌障礙而引起的有毒膽汁酸潴留的臨床綜合征，多種肝病是由膽汁淤積所發(fā)展而來(lái)，包括原發(fā)性硬化性膽管炎、膽汁淤積性肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化等[1]，其中膽汁淤積性肝炎在臨床中較為常見(jiàn)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)慢性肝病住院患者膽汁淤積性肝炎的發(fā)生率高達(dá)10%以上[2]。膽汁淤積性肝炎病因復(fù)雜，其與病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、藥物和（或）毒物、酒精、自身免疫、腫瘤和遺傳代謝等密切相關(guān)[3]。然而，臨床上用于膽汁淤積性肝炎的治療藥物仍較為欠缺，病人預(yù)后較差。目前，熊去氧膽酸是FDA 唯一批準(zhǔn)用于治療膽汁淤積的藥物，但其療效僅限于原發(fā)性膽汁性肝硬化的早期階段[4]。近些年來(lái)，針對(duì)膽汁淤積性肝炎治療方法雖然取得的一定的進(jìn)展，特別是越來(lái)越多的中藥有效成分逐漸被發(fā)現(xiàn)對(duì)膽汁淤積性肝炎展現(xiàn)出良好的防治作用[5-6]，但目前尋找、開(kāi)發(fā)具有高效低毒的抗膽汁淤積性肝炎新藥仍是科研工作者的首要任務(wù)。

素有護(hù)肝降酶之王美譽(yù)的白芷，研究表明其對(duì)肝纖維化有較好的保護(hù)作用，但其具體的護(hù)肝有效成分尚不明確[7]。作為白芷主要活性成分之一的白芷乙素，其具備出色的抗炎、抗氧化以及抗凋亡等藥理作用[8-9]。基于本課題組前期通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步針對(duì)白芷相關(guān)成分進(jìn)行篩查，包括歐前胡素、氧化前胡素、白芷乙素等，結(jié)果表明白芷乙素可較好地改善膽汁淤積性肝炎小鼠的癥狀，主要參考黎明等[10]白芷乙素的給藥劑量以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定20 mg/kg為本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)給藥劑量。截至目前，尚未發(fā)現(xiàn)白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎防治方面的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃1%ANIT 橄欖油溶液建立小鼠膽汁淤積性肝炎模型，基于PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路探討白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠的作用及其機(jī)制，為臨床治療膽汁淤積性肝炎新藥開(kāi)發(fā)提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑

白芷乙素購(gòu)于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；熊去氧膽酸膠囊購(gòu)于德國(guó)Losan-Pharma GmbH（250 mg/粒，批號(hào)：15A10039L）；α-萘異硫氰酸酯（ANIT）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；橄欖油購(gòu)于上海佳格食品有限公司；TNF-α和IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20 190612；20 190824；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、直接膽紅素（D-BIL）、間接膽紅素（I-BIL）、總膽汁酸（TBA）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司，批號(hào)分別為20200914、20200522、20200616、20200612、20200706、20200825、202011023、20201105、20 200514；PI3K、AKT 和p-GSK-3β單克隆抗體購(gòu)于abcam 公司，批號(hào)分別為MAB18743、MAB1386、DY524。

1.2 動(dòng)物分組與給藥

3月齡雄性C57BL/6小鼠32只，體質(zhì)量18～22 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCⅩK（京）2019-0008。動(dòng)物于SPF 環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分組，分別為正常對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、熊去氧膽酸組（ⅩQ，100 mg/kg）和白芷乙素組（BZ，20 mg/kg），每組8只。動(dòng)物造模48 h后灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，正常對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.3 小鼠膽汁淤積性肝炎模型建立

主要參照文獻(xiàn)[11]方法構(gòu)建小鼠膽汁淤積性肝炎模型，具體方法如下：小鼠禁食12 h（正常飲水），一次性灌胃給予1%ANIT 橄欖油溶液，按50 mg/kg體質(zhì)量給藥，誘發(fā)48 h，建立小鼠膽汁淤積性肝炎模型，正常對(duì)照組一次性灌胃給予等量橄欖油溶液。

1.4 肝組織病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小心切取肝右葉組織，浸泡于10%（φ）中性甲醛24 h，進(jìn)行石蠟包埋和HE染色，具體步驟如下：切取同一部位肝組織約2 mm，流水浸泡過(guò)夜，分別用70%（φ）乙醇、95%乙醇、100%乙醇浸泡5 h，二甲苯透明2 min，石蠟浸泡1 h（60 ℃）后進(jìn)行石蠟包埋、切片，其中切片厚度為4 μm。再按HE 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)步驟染色后，晾干、封片以及鏡檢。

1.5 血清肝功能酶、膽紅素以及膽汁酸水平檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，摘眼球取血，4 ℃放置2 h后，于4 ℃離心機(jī)中按3 500 r/min，離心15 min，分離血清，按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)血清ALT、AST、ALP、T-BIL、D-BIL、I-BIL 和TBA水平。

1.6 肝組織炎癥因子與氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

使用玻璃勻漿器，4 ℃環(huán)境中，取適量肝組織，制備10%肝組織勻漿，并4 ℃，3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清。按照ELISA 檢測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)肝組織勻漿中TNF-α、IL-1β、MDA 水平以及SOD活性。

1.7 肝組織PI3K/AKT/GSK-3β 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

聚丙烯酰胺凝膠電泳中每孔統(tǒng)一上樣為50 μg，常規(guī)電泳分離蛋白和轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜（PI3K、AKT 和p-GSK-3β、β-actin 均按1∶2 000 稀釋?zhuān)故覝胤跤? h，PBST洗膜3次，10 min/次，顯影劑浸泡后，使用凝膠成像系統(tǒng)成像曝光、拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析和LSD 檢驗(yàn)對(duì)多組間均數(shù)進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠肝組織病理學(xué)的影響

正常對(duì)照組肝組織整體結(jié)構(gòu)正常，膽囊呈淡黃色，未見(jiàn)腫大（圖1-A1），肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常、清晰，無(wú)異常（圖1-A2）；模型組可見(jiàn)肝組織腫大，呈淡黃色，膽囊腫大，呈褐色（圖1-B1），有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并有明顯的肝細(xì)胞壞死區(qū)域（圖1-B2）。白芷乙素組（圖1-C1、C2）和熊去氧膽酸組（圖1-D1、D2）上述癥狀明顯改善，膽囊腫大程度減輕（圖1-A3、A4），炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯減少，肝細(xì)胞壞死區(qū)域明顯減輕，未見(jiàn)明顯的成纖維細(xì)胞增生。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化（HE染色，100×）Figure 1 Hepatic histopathological changes of mice in each group

2.2 白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠血清肝功能酶的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清肝功能酶ALT、AST 和ALP 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，白芷乙素組和熊去氧膽酸組血清肝功能酶ALT、AST和ALP水平明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清ALT、AST和ALP水平Figure 2 Levels of ALT,AST and ALP in serum of mice in each group(,n=8)

2.3 白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠膽紅素和膽汁酸水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL和TBA水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，白芷乙素組和熊去氧膽酸組血清T-BIL、D-BIL、I-BIL和TBA水平明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL和TBA水平Figure 3 Levels of T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in serum of mice in each group(,n=8)

2.4 白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠肝組織炎癥因子TNF-α和IL-1β水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織炎癥因子TNF-α和IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，白芷乙素組和熊去氧膽酸組肝組織炎癥因子TNF-α和IL-1β水平明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠肝組織TNF-α和IL-1β水平Figure 4 Levels of TNF-α and IL-1β in liver tissue of mice in each group(,n=8)

2.5 白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD活性和MDA水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD 活性明顯降低（P＜0.01），MDA 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，白芷乙素組和熊去氧膽酸組肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD 活性明顯升高（P＜0.01），MDA水平明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠肝組織SOD活性和MDA水平Figure 5 Activity of SOD and levels of MDA in liver tissues of mice in each group(,n=8)

2.6 白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠肝組織PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織的PI3K 和AKT 的蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），而p-GSK-3β的蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，白芷乙素組和熊去氧膽酸組肝組織的PI3K 和AKT 的蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），而p-GSK-3β的蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠肝組織PI3K、AKT和p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平Figure 6 Expression levels of PI3K，AKT and p-GSK-3β protein in liver tissues of mice in each group(,n=3)

3 討論

膽汁淤積性肝炎好發(fā)于男青年，發(fā)病較為隱匿，早期癥狀不明顯，臨床表現(xiàn)特異性低，容易引起漏診和誤診，從而延誤病情。膽汁淤積性肝炎常可引起肝內(nèi)膽管堵塞，最終導(dǎo)致肝硬化，甚至肝衰竭。通過(guò)一次性灌胃給予1%ANIT 橄欖油溶液建立的小鼠膽汁淤積性肝炎模型是一種膽汁淤積性肝病的成熟模型，多用于動(dòng)物膽汁淤積性肝病的藥效及機(jī)制研究[12]。熊去氧膽酸是FDA 唯一批準(zhǔn)用于治療膽汁淤積的藥物，故本研究選用一次性灌胃給予1%ANIT橄欖油溶液建立的小鼠膽汁淤積性肝炎模型，以熊去氧膽酸為陽(yáng)性對(duì)照藥，探討白芷乙素對(duì)小鼠膽汁淤積性肝炎的藥效及機(jī)制。

血清肝功能酶、膽紅素以及膽汁酸是臨床上評(píng)價(jià)肝膽功能異常常用的檢測(cè)指標(biāo)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，白芷乙素和熊去氧膽酸均能明顯降低血清ALT、AST、ALP、T-BIL、D-BIL、I-BIL 和TBA 的水平，提示白芷乙素和熊去氧膽酸可能通過(guò)改善膽汁淤積性肝炎小鼠的肝膽功能，從而減輕膽汁淤積性肝炎的癥狀。同時(shí)肝組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)白芷乙素和熊去氧膽酸可減輕膽囊腫大程度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，減少肝細(xì)胞壞死區(qū)域。炎癥和氧化損傷是膽汁淤積性肝炎2 個(gè)重要的發(fā)病機(jī)理[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，白芷乙素和熊去氧膽酸可明顯降低肝組織TNFα、IL-1β和MDA 水平，明顯升高SOD 活性，提示白芷乙素和熊去氧膽酸可通過(guò)抗炎和抗氧化作用，抑制膽汁淤積性肝炎的發(fā)生發(fā)展。PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路是人體細(xì)胞內(nèi)較為重要的信號(hào)通路之一，與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝和凋亡等生物過(guò)程密切相關(guān)[16-17]。PI3K 作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，被激活后，可活化下游因子AKT。AKT磷酸化下游因子GSK-3β上的絲氨酸殘基，p-GSK-3β抑制了細(xì)胞色素C 的釋放和Caspase-3的活性，從而抑制肝細(xì)胞的凋亡過(guò)程[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，白芷乙素和熊去氧膽酸可明顯下調(diào)肝組織PI3K 和AKT 的蛋白表達(dá)量，而上調(diào)p-GSK-3β的蛋白表達(dá)量，提示白芷乙素和熊去氧膽酸可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路，抑制膽汁淤積性肝炎所致的肝細(xì)胞凋亡。

綜上所述，白芷乙素對(duì)膽汁淤積性肝炎小鼠具有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗炎、抗氧化應(yīng)激損傷以及調(diào)節(jié)PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。