和厚樸酚對非酒精性脂肪肝模型大鼠的改善作用

陸少君 ，蔡肇栩 ，陳文健，劉瑤

（1.廣東藥科大學實驗動物中心，廣東廣州 510006；2.肇慶市第一人民醫院藥學部，廣東肇慶 526000；3.廣州市婦女兒童醫療中心兒科研究所，廣東廣州 510006）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在無過量飲酒史的情況下，肝組織學的改變類似于酒精性肝病，表現特征主要為肝細胞內脂肪過度沉積和脂肪變性[1]。近年來隨著世界范圍內糖尿病和肥胖發病率的上升，NAFLD發展迅速，現已成為世界性最常見的肝臟疾病之一。全球流行病學研究顯示[2]，西方國家成年人中NAFLD 患病率約為20%～30%，而僅在美國，總人口的27%～34% 患有NAFLD，其中兒童占10%，75%～92%的病態肥胖患者也都患有NAFLD，這些NAFLD患者中有10%～15%發展為肝細胞癌。我國患病率低于西方國家，約為15%[3]，但隨著肥胖人群增加與代謝綜合征（metabolic syndrome,MS）的流行，患病率呈持續上升趨勢，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病，給人們日常生活及社會帶來極大負擔。因此，尋找改善和治療NAFLD 的藥物具有十分重要的意義。

中藥厚樸具有消除胸腹滿悶、止痛、健胃、止咳、祛除水毒、活血化瘀等作用[4]。和厚樸酚（honokiol,HNK）是中藥厚樸中提取純化的主要有效化學成分，相對分子質量為266，分子式為C18H18O2，其化學結構如圖1。屬于一種帶有烯丙基的連苯二酚類化合物[5]。現代醫學研究發現，HNK 具有抗炎[6]、抗衰老[7]、改善胃腸功能紊亂[8]及抗腫瘤[9]等廣泛的藥理作用，但關于HNK 對灌服高糖高脂乳劑[10]復制的NAFLD 大鼠模型的作用研究尚未見報道。因此，本研究擬用高糖高脂乳劑制備NAFLD 大鼠模型，以中藥單體HNK干預，探討HNK對NAFLD大鼠模型的改善作用。

圖1 和厚樸酚化學結構Figure 1 Chemical structure of honokiol

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，6周齡，廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCⅩK（粵）2018-0002。

1.2 藥物及試劑

HNK（廣州合誠化學有限公司）；辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市大茂化學試劑廠）；葡萄糖（廣州化學試劑廠）；三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、游離脂肪酸（FFA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；胰島素（FINS）檢測試劑盒[羅氏診斷產品（上海）有限公司]。

1.3 主要儀器

血糖儀及配套試紙[強生（中國）醫療器材有限公司]；FA2004B 電子天平（上海精科天美）；TC-120智能程控生物組織自動脫水機、TB-718D 生物組織自動包埋機、TB-718生物組織自動包埋機冷臺、TK-218Ⅱ型恒溫攤片烤片機、TR-180I型生物組織全自動染色機（湖北泰維科技公司）；RM2235 石蠟切片機（德國leica公司）；BA310正置顯微鏡及Motic Images Plus 3.0圖像采集系統（麥克奧迪）。

2 方法

2.1 藥物配制

辛伐他汀片及HNK 用0.5%CMC-Na 混懸后使用。

2.2 動物造模、分組及給藥

6 周齡雄性SD 大鼠60 只，適應性飼養3 d，隨機選取12 只大鼠作為正常對照組，灌服10 mL/kg生理鹽水，其余大鼠灌服等量高糖高脂乳劑復制NAFLD 大鼠模型。2 周后所有動物以乙醚麻醉，靜脈采血取血清測定TC 值，按TC 值把造模大鼠隨機分成模型對照組、辛伐他汀陽性組（8 mg/kg）及HNK高、低劑量組（200、50 mg/kg）。分組后上午造模給藥，下午治療給藥，正常對照組及模型對照組給予等量的0.5%CMC-Na溶液，給藥體積為10 mL/kg，連續給藥6周，期間所有大鼠給予普通飼料喂養。

2.3 指標觀察及測定

2.3.1 一般情況 實驗過程中，觀察各組大鼠的行為、精神狀態、毛發、排泄物等情況。

2.3.2 OGTT 試驗 末次給藥前各組動物禁食不禁水12 h，尾靜脈取血測定空腹血糖（FBG），隨即灌服2 g/kg 的葡萄糖，給藥體積為10 mL/kg，測定30、60、120 min 時間點的血糖值。以時間點為橫坐標，血糖值為縱坐標，繪制曲線，統計分析血糖曲線下面積（AUC）。

2.3.3 血清中生化指標檢測 末次給藥后各組動物禁食不禁水12 h，麻醉后靜脈取血，3 500 r/min 離心15 min 分離血清，測定大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA 及FINS 含量，計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

2.3.4 臟器系數 脫臼處死大鼠取肝臟、胰腺，稱質量并計算臟器系數，臟器系數=臟器濕質量（g）/體質量（g）×100%

2.3.5 肝組織病理形態學檢查 各組動物取相同部位肝組織，用10%（φ）甲醛溶液固定，常規脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察肝組織中肝細胞脂肪變性程度，小葉炎癥及肝細胞氣球樣變，參照文獻[11]評分標準進行NAFLD 活動度積分（non-alcoholic fatty liver disease activity score，NAS）評分。

2.4 統計學處理

以SPSS 22.0 軟件進行數據處理，實驗數據均用表示，各組均數間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

實驗期間正常對照組大鼠生長活動狀態良好，毛色光亮，精力充沛，排泄物未見異常。模型對照組動物精神低迷，毛發蓬亂無光澤，喜團聚蜷臥，大便不成型且氣味較臭。辛伐他汀組及HNK 給藥組較模型對照組活動狀態好，毛色有光澤，僅個別出現行動遲緩，皮毛欠光澤，拉稀便的現象。

3.2 HNK對NAFLD大鼠肝臟的影響

3.2.1 各組大鼠肝臟大體觀 正常對照組大鼠肝臟形態正常，色澤鮮紅，被膜光滑有彈性，邊緣銳利。模型對照組肝臟呈彌漫性腫大、被膜緊繃、土黃色、質脆，邊緣鈍厚，切面油膩，是典型的脂肪肝病變，肝臟系數顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組相比，HNK 高、低劑量組及辛伐他汀組大鼠肝臟色澤及病變均有明顯改善。見表1及圖2。

表1 HNK對NAFLD大鼠活動度積分的影響Table1 Effect of HNK on the activity score of rats with nonalcoholic fatty liver(,n=12)

表1 HNK對NAFLD大鼠活動度積分的影響Table1 Effect of HNK on the activity score of rats with nonalcoholic fatty liver(,n=12)

與正常對照組比較：△△P＜0.01；與模型對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

圖2 和厚樸酚對NAFLD大鼠肝臟的影響（HE，400×）Figure 2 Effects of HNK on liver of rats with nonalcoholic fatty liver disease(HE,400×)

3.2.2 各組大鼠肝組織病理改變 鏡下結果顯示正常對照組肝小葉結構完整，輪廓清晰可見，肝竇正常，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀整齊排列，肝細胞胞質均勻，呈多邊形，無變性；模型對照組肝小葉結構不清，可見淋巴細胞和漿細胞的炎性浸潤，細胞核偏移，肝竇數量減少，肝索排列紊亂，肝細胞內有明顯大小不等的脂滴空泡；辛伐他汀組及HNK高、低劑量組炎癥細胞浸潤現象明顯減輕，脂肪空泡明顯減少，肝細胞脂肪變性明顯改善，結果詳見圖2。表1 統計結果顯示：模型對照組的脂肪變、小葉內炎癥、氣球樣變評分及總評分NAS均顯著高于正常對照組（P＜0.01）；NAFLD 模型鼠在給予辛伐他汀及HNK 治療后，脂肪變、小葉內炎癥及氣球樣變評分均有不同程度的下降（P＜0.01 或P＜0.05），NAS 評分顯著小于模型對照組（P＜0.01）。結果表明HNK能改善NAFLD大鼠肝臟的肝細胞損傷。

3.3 HNK對NAFLD大鼠血脂水平的影響

表2結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組血清中TC、TG、LDL-C、FFA 水平顯著性升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，HNK 高、低劑量組血清中TG、FFA 水平顯著性下降（P＜0.01），HDL-C 顯著升高（P＜0.01），高劑量HNK 能顯著降低血清中TC水平（P＜0.05），低劑量HNK 則能有效控制NAFLD大鼠血清中的LDL-C 水平（P＜0.01）。表明HNK 對NAFLD大鼠的血脂紊亂有較好的調節效果。

表2 HNK對NAFLD大鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of HNK on blood lipid level in NAFLD rats(,n=12)

表2 HNK對NAFLD大鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of HNK on blood lipid level in NAFLD rats(,n=12)

與正常對照組比較：△△P＜0.01；與模型對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 HNK 對NAFLD 大鼠血糖、血清FINS、HOMAIR的影響

表3 結果顯示：模型對照組120 min 血糖水平、AUC 顯著性高于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，HNK 高、低劑量組120 min 時血糖及AUC顯著性降低（P＜0.01 或P＜0.05）。表4 結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組的胰腺系數、FINS 水平及HOMA-IR 顯著性升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，HNK 高、低劑量組的胰腺系數及HOMA-IR顯著性下降（P＜0.01 或P＜0.05）。表明HNK 能改善NAFLD 模型鼠因胰腺炎及胰腺中脂肪的蓄積引起的胰腺肥大，增加口服糖耐量，減輕胰島素抵抗。

表3 HNK對NAFLD大鼠血糖的影響Table 3 Effect of HNK on blood glucose in NAFLD rats(,n=12)

表3 HNK對NAFLD大鼠血糖的影響Table 3 Effect of HNK on blood glucose in NAFLD rats(,n=12)

與正常對照組比較：△△P＜0.01；與模型對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 HNK對NAFLD大鼠FINS水平和HOMA-IR 指數的影響Table 4 Effect of HNK on FINS level and HOMA-IR index in rats with nonalcoholic fatty liver disease(,n=12)

表4 HNK對NAFLD大鼠FINS水平和HOMA-IR 指數的影響Table 4 Effect of HNK on FINS level and HOMA-IR index in rats with nonalcoholic fatty liver disease(,n=12)

與正常對照組比較：△△P＜0.01；與模型對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

NAFLD 屬于一種具有高發病率的代謝紊亂性疾病，是最常見的肝臟疾病之一，其發病是一個多因素、多環節相互作用的過程。目前NAFLD的確切發病機制仍未被闡明，缺乏明確、系統的藥物治療策略，因此治療NAFLD的藥物研發依然任重而道遠。

糖脂代謝紊亂包括胰島素抵抗（IR）、糖耐量異常和脂質代謝改變，被認為是NAFLD 分子發病機制[12-13]。當機體飲食過度導致營養過剩時，脂質轉錄因子包括碳水化合物反應元件結合蛋白（ChREBP）以及甾醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）上調，導致脂肪生成基因的表達增加，乙酰輔酶a 羧化酶（ACC）升高，促進新生脂肪生成（NDL），抑制肝內脂肪酸氧化作用來驅動脂肪變性[14]。1998年Day和Jame[15]提出的“二次打擊”學說機制也認為高脂飲食患者由于攝入過量脂肪，引起血漿中游離的脂肪酸增加，導致胰島素抵抗，當機體產生胰島素抵抗時，其血液中的TG、LDL-C、極低密度脂蛋白膽固醇都會發生明顯升高[16]，進而產生脂質代謝紊亂。肝臟積聚了大量脂肪后，脂質會因為肝內自由基生成增多而過氧化，肝細胞也因此而凋亡、壞死，最終演變成脂肪性肝炎、肝細胞壞死、肝纖維化甚至肝硬化和肝癌。本研究結果表明，8 周高糖高脂乳劑誘導的NAFLD 大鼠血脂水平，肝臟、胰腺系數，AUC，血清FINS 含量及HOMA-IR 均顯著升高并出現典型的脂肪肝病樣變，與李易水等[17]所制備的高脂飲食的動物模型血脂水平、病理病變吻合。HNK 干預后，能降低血清TG、TC、LDL-C 及FFA，升高HDL-C，脂肪肝病樣變明顯改善，120 min 的血糖幾乎能恢復到初始血糖，表明HNK能調節血脂紊亂，有效對抗高糖高脂乳劑引起的肝臟損傷，改善葡萄糖調節受損和胰島素抵抗。

HNK 是一種安全、有效的強抗氧化劑[18]，并有很好的抗炎效果[8-19]。高脂飲食的大鼠肝臟中過氧化產物丙二醛（MDA）升高，超氧化物歧化酶（SOD）水平降低，氧化應激增加，抗氧化能力下降[20]，血清或肝臟中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等細胞因子亦會顯著增加[21-23]。因此，筆者認為HNK 可能抑制了NAFLD 模型大鼠機體內乳酸脫氫酶（HDL）和轉氨酶的釋放，有效控制肝細胞死亡和脂質過氧化，產生較高活性氧并消耗細胞內的谷胱甘肽，同時減少了促炎癥因子TNF-α及脂肪細胞因子FFA 的產生，從而起到肝臟細胞保護的作用。

綜上所述，HNK 對NAFLD 大鼠模型有調節血脂紊亂、改善肝臟損傷及胰島素抵抗的作用，但HNK對NAFLD大鼠模型的改善作用是一個多因素參與的復雜過程，其具體的作用機制有待更深入的探究。本研究為應用HNK 治療NAFLD 提供了實驗依據。