穿心蓮酸對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠主動脈病理及炎癥小體NLRP3通路的影響

賴亦靜 ，黃雪君，2，3 ，李鈺婷 ，彭莎 ，江潔怡，2，3 ，陳玉興，2，3，蔡大可，2，3，甘海寧，2，3

[1.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東廣州 510095；2.廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院），廣東廣州 510095；3.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州510095]

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管病的基礎性病變，可引起缺血性心臟病、中風和外周血管疾病等心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）。CVD是發達國家的主要死亡原因[1]，而在發展中國家與CVD有關的死亡人數也在不斷增加。AS在2種最常見的CVD——心臟缺血和腦血管疾病[2]的發病機制中起著預先決定作用，因此阻止AS的發生與進展已成為心血管疾病防治的研究重點。20世紀以來，脂質積累被認為在AS發展中起主導作用，1999年Ross提出AS是一種慢性炎癥反應[3]，炎癥是AS發生發展過程中的重要推動力，越來越多的研究證明炎癥因子和炎癥小體在AS的炎癥反應中起著關鍵作用，其中以NLRP3（NOD-，LRR-，and PYD-containing protein 3）為代表的炎性小體備受關注。NLRP3炎癥小體是一種細胞內模式識別受體，當配體與NLRP3結合后促進炎癥小體的形成，并對caspase-1 進行自身激活，最終導致白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和白介素-18（interleukin-18，IL-18）的成熟及分泌[4]，參與AS 的炎癥反應過程。課題組前期研究表明，穿心蓮內酯有減輕AS 炎癥反應、減緩主動脈斑塊形成的作用[5]。但穿心蓮內酯溶解性低，生物利用度低，課題組在對穿心蓮內酯結構修飾研究中發現其五元環內酯開環物穿心蓮酸的抗炎活性與穿心蓮內酯相當[6]，并能明顯影響caspase的表達[7]。本研究將基于NLRP3通路探討穿心蓮酸干預AS發生發展的作用，為AS的防治藥物研發提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑

瑞舒伐他汀鈣片（rosuvastatin），阿斯利康藥業（中國）有限公司，批號： 134454；穿心蓮酸（andrographolic acid），廣東省中醫藥工程技術研究院制備[7]。小鼠高脂飼料含76.5%標準飼料、0.5%膽酸鈉、5%蔗糖、3%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉，購自廣東省醫學實驗動物中心。NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 抗體，購自美國Proteintech。膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物

SPF 級ApoE-/-小鼠50 只，C57BL/6 小鼠10 只，雄性，5～6 周齡，體質量（22±2）g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號SCⅩK（粵）2018-0002。

1.3 主要儀器

BS224S 電子天平（1/萬）（德國SARTORIUS）；5418 型小型高速冷凍離心機（德國Eppendorf）；Varioskan Flash 型全波長多功能酶標儀（美國Thermo）；SmartSpec plus 核酸蛋白測定儀、miniprotean Teral Cell 垂直電泳槽、PowerPac Basic 電泳儀（美國Bio-Rad）；5200 Multi 多功能成像系統（上海Tanon）；BⅩ51顯微鏡（日本Olympus）。

2 方法

2.1 動物分組與造模

ApoE-/-小鼠適應性喂養1周后每籠小鼠每天定量給予高脂飼料20 g，連續8 周，C57BL/6 小鼠作為野生型對照組小鼠給予普通配合飼料。第8 周末，小鼠眼眶靜脈叢采血，按TC 水平將進食高脂飼料小鼠隨機分為5 組，每組10 只，分別為模型組、瑞舒伐他汀組、穿心蓮酸高、中、低劑量組。瑞舒伐他汀片臨床每日口服1 粒，相當于10 mg 瑞舒伐他汀，根據體表面積換算[8]小鼠等效劑量為1.3 mg/kg。根據前期實驗結果設置穿心蓮酸高、中、低劑量分別為25、12.5、6.25 mg/kg。

2.2 動物給藥及取材

從第8 周開始，各給藥組給予相對應藥物灌胃20 mL/kg，正常對照組和模型組給予等容量蒸餾水灌胃，每天1 次，連續8 周。末次給藥前12 h 禁食不禁水。末次給藥后1 h，小鼠眼眶靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min取血清，置于-80 ℃冰箱保存；取部分主動脈置于中性甲醛溶液固定，取另一部分主動脈置于液氮速凍后-80 ℃保存。

2.3 檢測指標

2.3.1 血脂水平 根據試劑盒說明書，檢測血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.3.2 主動脈病理形態檢測 將中性甲醛溶液固定的主動脈，按照常規方法制作石蠟切片，進行油紅O染色。染色前將切片在室溫下放置20 min，待載玻片上水汽消失后，油紅O 染液染色8 min，85%異丙醇洗15 s，蒸餾水洗1 min。蘇木精染色5 min，蒸餾水洗2 min，用水溶性封片劑封片，顯微鏡觀察主動脈斑塊變化。

2.3.3 Westernblot蛋白免疫印跡分析NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 的表達 將RIPA 裂解液與PMSF、蛋白酶/磷酸酶抑制劑按照100∶1∶1（體積比）配制成濃度為含1%PMSF 及蛋白酶/磷酸酶抑制劑的組織裂解液，置于冰上預冷，現配現用。取出-80 ℃冰箱保存的小鼠主動脈，加入1 mL 組織裂解液，用電動勻漿器在冰上充分研磨后，放置10 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，棄去沉淀，按照BCA蛋白定量檢測試劑盒的方法，測定各樣品A值，計算每個樣品蛋白濃度。吸取調整后的蛋白樣品80 μL，加入20 μL 的5×上樣緩沖液，充分混勻后，100 ℃加熱5 min，使蛋白質充分變性。提取的蛋白經電泳、轉膜、封閉后，加入相應的一抗，4 ℃環境中孵育過夜后將膜取出，吸去一抗，洗滌3 次后加入相應的二抗，室溫搖床孵育90 min，80 r/min，吸去二抗，洗滌3 次后將PVDF 膜保存在PBST 洗滌液中，在暗室中將PVDF膜置于ECL發光顯影液中1～2 min，使用凝膠自動成像系統對PVDF 膜進行拍攝，并用Image J軟件對蛋白條帶灰度進行半定量分析，計算各組目的蛋白表達水平。

2.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件，計量資料以表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，先行Levene Statistic 方差齊性檢驗。方差齊時，采用SNK 檢驗進行組間均值兩兩比較；方差不齊時，采用Dunnett T3檢驗進行組間均值兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 穿心蓮酸對AS小鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C含量顯著性升高（P＜0.01），HDL-C 含量顯著性降低（P＜0.05）；與模型組比較，瑞舒伐他汀組和穿心蓮酸高、中、低劑量組TC 含量顯著性降低（P＜0.05），HDL-C含量顯著性升高（P＜0.05），瑞舒伐他汀組和穿心蓮酸高、中劑量組LDL-C 含量顯著性降低（P＜0.05），各給藥組TG 含量與模型組比較差異無統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C含量Table 1 Level of Serum TC,TG,LDL-C,HDL-C in different groups(,n=10)c/(mmol·L-1)

表1 各組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C含量Table 1 Level of Serum TC,TG,LDL-C,HDL-C in different groups(,n=10)c/(mmol·L-1)

與正常對照組比較：**P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05。

3.2 穿心蓮酸對AS小鼠主動脈病理學的影響

正常對照組小鼠主動脈壁厚薄均勻，主動脈內膜光滑平整，內膜各層結構正常，未發現明顯的動脈粥樣硬化病灶。模型組可見動脈管腔不平，管腔內膜增厚，斑塊明顯紅染，脂質浸潤斑塊增多明顯；瑞舒伐他汀組、穿心蓮酸高劑量組的主動脈壁各層結構正常，局部可見較小斑塊，病變程度明顯較輕；穿心蓮酸中、低劑量組的主動脈壁增厚，脂質浸潤斑塊明顯較多。見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈病理學形態觀察（油紅O染色，40×）Figure 1 Histopathological changes in the aorta of mice in different groups(Oil red staining,40×)

3.3 穿心蓮酸對AS 小鼠主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表達的影響

與正常對照組比較，模型組caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達量顯著性升高（P＜0.05），NLRP3 蛋白表達量有升高趨勢但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，穿心蓮酸高、中、低劑量組NLRP3、caspase-1蛋白表達量顯著性降低（P＜0.05），穿心蓮酸高、中劑量組IL-1β、IL-18 蛋白表達量顯著性降低（P＜0.05），瑞舒伐他汀組caspase-1 蛋白表達量顯著性降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達Figure 2 Protein expressions of NLRP3,caspase-1,IL-1β and IL-18 in the aorta of mice from each group(,n=3)

4 討論

高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠建立AS 模型，脂質代謝出現紊亂，脂質在主動脈內膜下沉積并伴隨內膜增厚，發生炎性浸潤等。在本實驗中，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低，胸主動脈病理切片油紅O 染色顯示主動脈壁粗糙，內膜明顯增厚，斑塊增多，脂質明顯浸潤。穿心蓮酸干預后，血脂水平明顯改善，主動脈病變得到不同程度改善，穿心蓮酸高中低劑量血清TC 及LDL-C 水平顯著下降，HDL-C 水平顯著升高，穿心蓮酸高劑量組主動脈壁各層正常，斑塊較少，脂質浸潤明顯減輕，與瑞舒伐他汀組相近，表明穿心蓮酸可改善血脂水平，減輕AS小鼠主動脈病變。

脂質沉積和炎癥反應是動脈粥樣硬化的2個主要特征，兩者相互作用、互為因果共同構成了AS 的基本發病機制。AS 相關病變中并不存在微生物感染，其無菌炎癥主要是由炎癥小體活化。NLRP3炎癥小體是一種細胞內模式識別受體，當配體與NLRP3結合后促進炎癥小體的形成，NLRP3的配體主要是內源性的，膽固醇、脂蛋白、細胞壞死成分等都可以激活NLRP3炎癥小體在非感染情況下引發和維持慢性炎癥反應[9]。在動脈粥樣硬化發展的過程中，膽固醇是炎癥小體通路的重要激活劑，在疾病早期就發揮重要作用，膽固醇結晶可以通過激活巨噬細胞內的NLRP3 炎癥小體參與AS 的早期形成，其依賴于caspase-1 的激活促成IL-1β的釋放[10]。當配體與NLRP3蛋白的LRR 結構域結合后NLRP3被活化，暴露PYD，再通過PYD-PYD 相互作用與其接頭蛋白ASC 結合，由ASC 的CARD 結構域招募procaspase-1，形成炎癥小體，并對caspase-1進行自身激活，活化后的caspase-1 對pro-IL-1 和pro-IL-18 等底物進行切割，促進IL-1β和IL-18的成熟及分泌[11]。

大量研究證明了NLRP3炎性小體在人類心血管疾病中的突出作用，冠狀動脈粥樣硬化患者在大動脈的NLRP3表達比無癥狀斑塊患者顯著增加，NLRP3炎性小體信號通路包括NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18在大動脈中表達顯著增強，這與疾病嚴重程度及CVD 的危險因素有關[12-14]。有研究發現丹參酮ⅡA顯著降低體內及體外模型的NLRP3炎性小體的啟動和激活，從而改善了AS的病變程度[15]。本實驗結果顯示，AS模型小鼠胸主動脈NLRP3炎癥小體蛋白表達有升高趨勢，穿心蓮酸各劑量組可有效降低NLRP3炎癥小體表達。模型組NLRP3蛋白表達水平雖有升高，但差異無顯著性可能與不同動物模型有關，也可能受激活NLRP3的其他通路的影響[16]。

在動脈粥樣硬化斑塊中caspase-1的活化標志著炎癥小體的活化。caspase-1是主要的IL-1處理蛋白酶，作為酶原大量存在于造血細胞中，需要炎癥小體的激活。IL-1β前體pro-IL-1β沒有生物活性，需要caspase-1進行蛋白水解，導致IL-1β活性細胞因子的分泌。IL-1β是參與炎癥反應的重要細胞因子，不僅自身參與急慢性炎癥反應，更能誘發其下游多種炎癥介質的釋放，從而在動脈硬化發生發展的炎癥反應過程中發揮重要作用[17-18]。最近Canakinumab抗炎性血栓形成結果研究（CANTOS）[19]結果顯示，針對IL-1β通路的抗炎治療顯著降低了心血管事件的復發率，此外以IL-1β抑制為例的進一步研究強調了抗炎藥物潛在的治療價值[20]。人體動脈粥樣硬化斑塊，尤其是斑塊巨噬細胞中高表達IL-18，并且IL-18 水平升高與動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性相關[21]，IL-18 缺陷能使ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化有所改善[22]。本實驗結果顯示，AS模型小鼠胸主動脈caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達水平顯著升高，穿心蓮酸高、中劑量組均可有效地降低caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達。以上結果表明穿心蓮酸可能通過NLRP3炎癥小體相關通路，降低AS 模型主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β及IL-18的表達水平，減輕炎癥對AS的影響。

綜上所述，本研究表明穿心蓮酸可以調節ApoE-/-小鼠AS 模型的血脂水平，改善主動脈病變及脂質沉積，下調主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β及IL-18 表達，減輕炎癥反應，發揮明顯抗AS 作用，調控NLRP3炎癥小體可能是穿心蓮酸發揮抗AS作用機制之一。