響應(yīng)面法優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏提取工藝

李菁 ，耿萌萌 ，余靚 ，盧美彤 ，于佳琳 ，張頌揚(yáng)，王小平，2*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)服務(wù)中心，陜西咸陽(yáng) 712046）

養(yǎng)顏玉肌膏是在《醫(yī)宗金鑒》收載的五味消毒飲的基礎(chǔ)上加減而成，主要由金銀花、野菊花、三色堇及玫瑰花組成，金銀花（Lonicera japonicaFlos）味甘、性寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱，消腫、治瘡之功效[1-3]，為方中主藥；野菊花（ChrysanthemiindiciFlos）味苦、辛，性微寒，歸肝、心經(jīng)，具有清熱解毒、瀉火平肝等功效[1]；三色堇為堇菜科三色堇（Viola tricolorL.）的干燥全草，《中華本草》記載味苦、性寒，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、去瘡消腫之功效，野菊花和三色堇均為佐藥；玫瑰花（Rosae rugosaeFlos）味甘、微苦，性溫，具有行氣解郁、活血止痛等功效[1，4]，為使藥。各藥合用，其清熱解毒之功效較佳。中醫(yī)研究表明，痤瘡與風(fēng)熱外襲、肺經(jīng)郁熱、胃腸積熱、血熱偏盛有關(guān)[5]。本研究在五味消毒飲的基礎(chǔ)上進(jìn)行加減，旨在研制一款治療痤瘡的膏劑——養(yǎng)顏玉肌膏。綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C是金銀花、野菊花和玫瑰花的主要成分之一，具有解熱抗炎、抗菌、抗氧化、抗抑郁、抗焦慮等藥理作用[6-10]，因此，本研究以綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏的提取工藝，為養(yǎng)顏玉肌膏的制備及后續(xù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽默飛Ultimate 3000 全自動(dòng)高效液相色譜儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司）；Direct-Q3 UV 純水超純水一體機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；HⅩ-25 電熱恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度：0.01 mg，量程：81 g/220 g～0.01 g/0.1 mg）；DHG-9075A 干燥箱（上海恒科有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

金銀花（Lonicera japonica Flos）、三色堇（Viola tricolor L.）、野菊花（Chrysanthemi indici Flos）和玫瑰花（Rosae rugosae Flos）飲片，購(gòu)自嵐皋縣和平大藥房有限責(zé)任公司且經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶教授鑒定為忍冬（Lonicera japonicaThunb.）、三色堇（Viola tricolorL.）、野菊（Chrysanthemum indicumLinnaeus）和玫瑰（Rosa rugosaThunb.）的干燥花，金銀花、野菊花和玫瑰花經(jīng)檢驗(yàn)均符合2020 年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)；綠原酸（HPLC≥98%，批號(hào)B20782），異綠原酸A（HPLC≥98%，批號(hào)B21539）和異綠原酸C（HPLC≥98%，批號(hào)B21539）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，磷酸、乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品、異綠原酸A對(duì)照品、異綠原酸C對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成每1 mL 含0.285 mg 綠原酸、0.151 mg 異綠原酸A、45 μg 異綠原酸C 的儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述3 種儲(chǔ)備液各135 μL，置2 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰適量，粉碎成粗粉，按照質(zhì)量比4∶4∶1∶1，稱取上述4 種粗粉共10 g，精密稱定，加入10 倍量50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇回流1.0 h，冷卻，過濾，取續(xù)濾液1 mL，置100 mL 量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.1.3 陰性溶液的制備 取三色堇粗粉1 g，精密稱定，加入10 倍量50%乙醇回流1.0 h，冷卻，過濾，取續(xù)濾液1 mL，置100 mL 量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液即為陰性溶液。

2.1.4 色譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～8 min，14%～19%A；8～14 min，19%A；14～34 min，19%～31%A；34～35 min，31%～90%A；35～40 min，90%A）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；進(jìn)樣量為10 μL。3 種酚酸類成分的色譜峰分離良好，陰性無(wú)干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatography chart

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.1.1”項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，測(cè)定3 種成分的峰面積，以質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），計(jì)算回歸方程見表1。

表1 3種酚酸類成分線性范圍Table 1 Linear range of three phenolic acids

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積的RSD 值依次為0.13%、0.18%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材粉末，按“2.1.2”項(xiàng)方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)色譜條件分析，結(jié)果測(cè)得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值依次為1.79%、1.38%、0.62%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)色譜條件，分別在0、1、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積的RSD 值依次為1.25%、0.98%、1.13%，表明供試品溶液中上述3種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 按照質(zhì)量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共5 g，精密稱定，平行6 份，按照1∶1 分別加入一定量的對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 的加樣回收率分別為95.45%、97.81%、98.25%，均在95%～105%之間且RSD 值均小于3%，表明方法的加樣回收率符合要求。

2.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別考察料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)對(duì)綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C提取量的影響。

2.3.1 料液比 按照質(zhì)量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，依次按料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（每個(gè)料液比平行3份）加入70%的乙醇溶液，回流提取1.5 h，提取1 次，測(cè)定3種酚酸類成分的峰面積，并計(jì)算3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖2。可見，綜合考慮3種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及能耗等因素[11]，選定料液比（g∶mL）為1∶8。

圖2 不同料液比對(duì)3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 2 Effect of different solid-liquid ratio on total contents of three components(n=3)

2.3.2 提取時(shí)間 按照質(zhì)量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，加入70%的乙醇80 mL，依次提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h（每個(gè)提取時(shí)間平行3 份），提取1 次，測(cè)定3 種酚酸類成分的峰面積，并計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖3?？梢?，提取時(shí)間1.0 h 時(shí)，3 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，故選定提取時(shí)間為1.0 h。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 3 Effects of different extraction time on total contents of three components(n=3)

2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù) 按照質(zhì)量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，按照料液比為1∶8，分別加入30%、50%、70%、90%（每個(gè)體積分?jǐn)?shù)平行3份）的乙醇，回流提取1.0 h，提取1 次，測(cè)定3 種酚酸類成分的峰面積，并計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖4。可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，3 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，故選定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 4 Effects of different alcohol concentrations on the total contents of three components(n=3)

2.3.4 提取次數(shù) 按照質(zhì)量比4∶4∶1∶1，分別取金銀花、野菊花、三色堇、玫瑰粗粉共10 g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液80 mL，回流提取1.0 h，分別提取1、2、3次（每個(gè)次數(shù)平行3份），測(cè)定3種酚酸類成分的峰面積，并計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖5?？梢姡崛〈螖?shù)為1次時(shí)，3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，故選定提取次數(shù)為1次。

圖5 不同提取次數(shù)對(duì)3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 5 Effect of different extraction times on the total contents of the three components(n=3)

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 從單因素考察結(jié)果，初步確定料液比（g∶mL）為1∶8，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，回流提取時(shí)間為1.0 h，提取1 次較為合適，在此基礎(chǔ)上，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為影響因素，3種成分含量總和（mg/g）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert 11軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3 因素3 水平17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。因素水平見表2，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table 2 Factors and Levels of response surface method

2.4.2 數(shù)學(xué)模型的建立及分析 使用Design Expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面擬合分析，得到編碼回歸方程為Y=31.93-0.091 2A+0.373 0B+0.258 8C+0.612 5AB+0.194 0AC+0.793 5BC-7.98A2-4.08B2-8.34 C2，R2=0.962 8，接近1，說明通過二次回歸得到綜合評(píng)分模型與試驗(yàn)擬合較好。方差分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface method

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of regression model

由表4可知，模型極顯著（P=0.003），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.429 5），說明此模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各因素對(duì)3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響由大到小的順序B＞C＞A，即提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比，其中二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01）。

2.4.3 響應(yīng)面交互作用 分析響應(yīng)面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，3D圖坡度越陡表示兩因素交互作用越大，等高線的形狀反應(yīng)因素間的交互作用，等高線為橢圓形表明兩者的交互作用顯著[12-14]。由圖6可見，料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的曲線最陡峭、提取時(shí)間次之，說明料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值（3 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的影響更顯著，也與表4 中BC（P=0.447 2）＞AB（P=0.554 0）＞AC（P=0.849 5）相對(duì)應(yīng)。

圖6 各因素交互作用的曲面圖與等高線圖Figure 6 Curved surface and contour maps of interaction effects of various factors on total phenolic acid content

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)Design-Expert 10.0.7 軟件計(jì)算得到養(yǎng)顏玉肌膏的最佳提取工藝為：料液比（g∶mL）為1∶8，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間為1 h，預(yù)測(cè)值為31.926 mg/g。采用最佳提取工藝，3 批供試品中3種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（30.763±1.53）mg/g（n=3），與預(yù)測(cè)值31.926 mg/g接近，表明方法穩(wěn)定可行。

3 討論

中藥常用的提取方法有浸漬法、煎煮法、超聲提取法、回流提取法和連續(xù)回流提取法等[15]，而回流法對(duì)綠原酸等成分的提取率相對(duì)較高[16-19]。提取工藝優(yōu)化常用的設(shè)計(jì)方法有響應(yīng)面法、正交試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)等，均勻設(shè)計(jì)適用于水平數(shù)較多，且各因素水平數(shù)不等的情況；正交試驗(yàn)具有試驗(yàn)組數(shù)少的優(yōu)點(diǎn)，但不能很好地考察因素間的交互作用且回歸模型的精度與預(yù)測(cè)性較差[20]，不能用于連續(xù)變量的優(yōu)化等，常用于初步篩選；而響應(yīng)面法可全面考察影響因素之間的交互作用，適用于連續(xù)變量的優(yōu)化，得到高精度的回歸方程，改善正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中存在的不足[21-22]。因此，本研究選用響應(yīng)面法優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏回流提取工藝。

通過前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)，考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素，對(duì)綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C 3 種成分提取的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置響應(yīng)面法的因素水平，以上述3 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化養(yǎng)顏玉肌膏的提取工藝，得到最優(yōu)工藝為料液比（g∶mL）為1∶8，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間1 h，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與預(yù)測(cè)值相接近，說明響應(yīng)面法優(yōu)化回流提取工藝的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，工藝穩(wěn)定、可行，為養(yǎng)顏玉肌膏的制備及開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

現(xiàn)代科學(xué)研究表明，綠原酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽等多種藥理作用，異綠原酸A 有較強(qiáng)的抗氧化作用[23-24]。2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定金銀花中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于1.5%，綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 總量不得少于3.8%，經(jīng)測(cè)定本研究所用金銀花中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（6.132 3±1.72）mg/g（＞1.5%），上述3 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（15.765 6±2.35）mg/g（＞3.8%），符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)；而養(yǎng)顏玉肌膏中綠原酸含量為（17.026 6±2.09）mg/g，上述3 種成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（30.763±1.53）mg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于金銀花中的含量，這可能與野菊花、玫瑰花中含有綠原酸有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8-12]，也可能是處方中的其他成分對(duì)上述成分的助溶作用有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。