參芪扶正注射液對支氣管擴張癥伴銅綠假單胞菌感染患者Th17/Treg免疫失衡的影響

楊麗莉 ，王兆邦 ，陳芳 ，王婉華，廖雪

（東莞市濱海灣中心醫院1.健康管理科；2.呼吸內科，廣東東莞 523900；3.暨南大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510630）

支氣管擴張癥作為一種氣道慢性化膿性炎癥引起的支氣管樹病理性、永久性擴張的肺疾病，頻繁反復發作不僅會引起肺功能惡化，還可能出現慢性肺源性心臟病甚至呼吸衰竭，加重患者病情[1]。病原體、宿主微生物群和宿主炎癥、免疫調節之間相互作用被證實為支氣管擴張發生進展的重要病理基礎[2]，而革蘭陰性菌作為支氣管痰檢陽性的主要致病菌，又以銅綠假單胞菌檢出率最高[3]。中醫認為治療支氣管擴張癥應扶正驅邪、標本兼治[4]，參芪扶正注射液作為臨床上輔助調節癌癥、肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病等調節免疫功能的藥物[5-6]，具有較好的應用前景。相關研究結果表明，中性粒細胞作為支氣管擴張癥最重要的炎癥細胞，當患者處于急性加重或者細菌感染時水平顯著升高[7]，而輔助性T 細胞17（T helper cell 17,Th17）/調節性T 細胞（T rgulatory cells,Treg）作為機體重要的免疫細胞，可通過影響中性粒細胞進而調控細菌侵襲引起的炎癥反應[8]。高遷移率族蛋白B1（high-mobilitygroup box1,HMGB1）作為關鍵的啟動和維持炎癥瀑布式反應的炎癥分子，影響多種炎癥疾病的進展[9]；晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products,RAGE）作為免疫球蛋白超家族中第一個被鑒定出來HMGB1 受體，結合后可直接或間接的對Treg/Th17細胞產生影響[10]，但在支氣管擴張癥疾病中的有關研究鮮少報道。本研究旨在探究參芪扶正注射液對銅綠假單胞菌感染支氣管擴張癥患者體內HMGB1/RAGE 通路表達及Th17/Treg免疫失衡的影響。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取東莞市濱海灣中心醫院2018年5月7日－2021年5月8日期間收治的58例支氣管擴張合并銅綠假單胞菌感染患者為研究組。納入標準：（1）符合《成人支氣管擴張癥診治專家共識》[11]中相關診斷標準；（2）連續2次痰培養銅綠假單胞菌陽性；（3）年齡20～80歲。排除標準：（1）臨床資料不完整；（2）合并其他肺部疾病無法進行肺泡灌洗術或對相關用藥不耐受者；（3）痰培養合并其他病原菌；（4）合并嚴重心、肝、腎功能不全者；（5）入院前1個月內接受過抗菌藥或免疫抑制藥物治療；（6）合并自身免疫缺陷病或血液系統疾病；（7）合并惡性腫瘤。另按1∶1配對納入58例體檢科正常人為健康對照組，入選標準：每年體檢，無腫瘤、糖尿病、冠心病、高血壓病、心力衰竭、慢性腎功能不全、周圍血管病、腦卒中等疾病。所有研究對象均對研究知情且自愿簽署同意書，本研究經醫院倫理委員會審核批準。

研究組隨機數字表法分為A 組和B 組各29 例。A 組中男性10 例，女性19 例，年齡21～71 歲，平均（45.41±8.39）歲，體重指數平均（20.82±2.37）kg/m2；病程平均（7.32±3.19）年；FEV1占預計值（63.49±13.94）%，FVC占預計值（73.83±13.73）%；過去1年急性加重次數1次11例，2次及以上18例。B組中男性12例，女性17例，年齡20～74歲，平均（44.37±7.61）歲，體重指數平均（20.98±2.64）kg/m2；病程平均（7.83±3.52）年；FEV1占預計值（64.04±13.94）%，FVC 占預計值（73.57±12.98）%；過去1年急性加重次數1次12例，2次及以上17例。健康對照組中男性24例，女性34例，年齡20～73 歲，平均（45.04±8.39）歲，體重指數平均（20.33±2.45）kg/m2；FEV1 占預計值（83.49±8.94）%，FVC 占預計值（83.16±8.34）%。各組的性別、年齡、體重指數等比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 A 組與B 組患者均給予霧化吸入、普通吸痰管吸痰、經驗性抗菌藥物、水電解質平衡、營養支持及對癥治療等常規治療方式。A 組患者在此基礎上采取纖維支氣管鏡與肺泡灌洗術，術前4～6 h 禁食飲水，咽喉部局部麻醉后常規檢測心電、呼吸、血氧飽和度檢測，經鼻插入纖維支氣管鏡，吸除氣道內分泌物，將預先加熱至37 ℃的無菌生理鹽水（20 mL）以一次性注射器由吸引孔緩慢推入至支氣管內，操作中注意觀察患者，避免嗆咳情況，負壓回收灌洗液，反復多次沖洗，直至液體清亮，收集灌洗液30～50 mL，將收回的液體經無菌紗布去除黏液，放至無菌容器中，用于Th17/Treg 細胞流式細胞術檢測的樣本于24 h 內檢測，炎性因子檢測的樣本于-70 ℃保存。B組患者在A組基礎上給予參芪扶正注射液（麗珠集團利民制藥廠，國藥準字Z19990065，規格：250 mL/瓶）輔助治療（取250 mL參芪扶正注射液行靜脈滴注，1 次/d）。灌洗術每周灌洗3次，兩組共持續治療14 d。

1.2.2 外周血樣本采集及單個核細胞分離 取健康對照組及研究組患者治療前、后空腹靜脈血5 mL各2支，1支置于枸櫞酸鈉抗凝劑的無菌試管中；1支置于的普通無菌干燥試管中，離心，提取上清液，然后置于-80 ℃冰箱備用。采用Ficoll 密度梯度離心法[12]分離得到外周血單個核細胞（PBMCs）。

1.2.3 Western blot檢測外周血及灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達 使用蛋白提取試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）提取單個核細胞及肺泡灌洗液中的總蛋白，采用Bradford 法測定蛋白濃度并調整各組蛋白濃度一致，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至甲醛預處理過的PVDF 膜，密封2 h，加入兔抗人HMGB1、RAGE、GAPDH 一抗（1∶500）（均購自Thermo Fisher Scientific）4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗40 min，加入HRP標記的二抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL試劑盒與DNR BioImaging System觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用凝膠圖像處理系統軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。

1.2.4 流式細胞術檢測外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg 細胞占比 采用美國BD 生物科技有限公司生產的試劑盒處理樣品，流式細胞術檢測Th17細胞和Treg細胞水平。具體步驟見試劑盒說明書。

1.2.5 ELISA 技術檢測肺泡灌洗液及外周血中炎癥細胞因子水平 根據酶聯免疫吸附試劑盒相關說明，檢測Th17、Treg 細胞占比及標志性促炎細胞因子[白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-6（IL-6）]，抗炎細胞因子[轉化生長因子-β1（TGF-β1）、白細胞介素-10（IL-10）]水平。

1.3 觀察指標

（1）健康對照組受試者及研究組患者單個核細胞及灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達水平；（2）健康對照組受試者及研究組患者單個核細胞及灌洗液中Th17、Treg 細胞占比及標志性炎性細胞因子[白細胞介素-17（Interleukin 17，IL-17）、IL-6、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）、IL-10]水平；（3）A組和B組患者治療前后單個核細胞及灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達水平；（4）A 組和B 組患者治療前后單個核細胞及灌洗液中Th17、Treg細胞占比及IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計學軟件處理數據，計量資料符合正態分布采用均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組與健康對照組結果比較

2.1.1 外周血中HMGB1、RAGE 蛋白表達及Th17、Treg細胞占比比較 研究組患者外周血中HMGB1、RAGE 蛋白表達水平均高于健康對照組（P＜0.01）；Th17 細胞占比高于健康對照組（P＜0.01），Treg 細胞占比低于健康對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組受試者單個核細胞中HMGB1、RAGE蛋白表達及外周血中Th17、Treg細胞占比比較Table 1 Comparison of HMGB1 and RAGE protein expression in mononuclear cells and Th17 and Treg cell levels in peripheral blood of two groups(,n=58)

表1 兩組受試者單個核細胞中HMGB1、RAGE蛋白表達及外周血中Th17、Treg細胞占比比較Table 1 Comparison of HMGB1 and RAGE protein expression in mononuclear cells and Th17 and Treg cell levels in peripheral blood of two groups(,n=58)

與健康對照組比較：**P＜0.01。

2.1.2 外周血炎性細胞因子水平比較 研究組患者外周血中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10 水平高于健康對照組（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組受試者外周血IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 2 Comparison of peripheral blood IL-17,IL-6,TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups(,n=58) ρ/(pg·mL-1)

表2 兩組受試者外周血IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 2 Comparison of peripheral blood IL-17,IL-6,TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups(,n=58) ρ/(pg·mL-1)

與健康對照組比較：**P＜0.01。

2.2 研究組A組和B組患者結果比較

2.2.1 外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白表達比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白均降低（P＜0.05），且B 組患者HMGB1、RAGE蛋白降低更顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE蛋白表達比較Table 3 Comparison of HMGB1 and RAGE expression in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groupsbefore and after treatment(,n=29)

表3 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE蛋白表達比較Table 3 Comparison of HMGB1 and RAGE expression in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groupsbefore and after treatment(,n=29)

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時間點比較：#P＜0.05。

2.2.2 外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg細胞占比比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血及肺泡灌洗液中Th17 細胞占比降低，Treg 細胞水平升高（P＜0.05），且B 組患者Th17、Treg 細胞占比變化更顯著（P＜0.05）。見表4。

表4 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg細胞占比比較Table 4 Comparison of Th17 and Treg cell levels in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29)%

表4 研究組患者治療前后外周血及肺泡灌洗液中Th17、Treg細胞占比比較Table 4 Comparison of Th17 and Treg cell levels in peripheral blood and alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29)%

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時間點比較：#P＜0.05。

2.2.3 外周血及肺泡灌洗液中炎性細胞因子水平比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血及肺泡灌洗液中IL-17、IL-6 細胞水皮降低，TGF-β1、IL-10細胞水平升高（P＜0.05），且B 組患者上述炎癥細胞因子變化更顯著（P＜0.05）。見表5～表6。

表5 研究組患者治療前后外周血中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 5 Comparison of peripheral blood IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/（pg·mL-1）

表5 研究組患者治療前后外周血中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 5 Comparison of peripheral blood IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/（pg·mL-1）

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時間點比較：#P＜0.05。

表6 研究組患者治療前后肺泡灌洗液中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 6 Comparison of IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels in alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/(pg·mL-1)

表6 研究組患者治療前后肺泡灌洗液中IL-17、IL-6、TGF-β1、IL-10水平比較Table 6 Comparison of IL-17，IL-6，TGF-β1 and IL-10 levels in alveolar lavage fluid between the two groups before and after treatment(,n=29) ρ/(pg·mL-1)

與同組治療前比較：*P＜0.05；與A組同時間點比較：#P＜0.05。

3 討論

近側支氣管、管壁肌肉及彈性組織結構的完整性破損是支氣管異常擴張的病理表現，而在感染及其他外在因素多次反復作用下，上述支氣管結構的損傷逐漸加重，會進一步影響纖毛功能，氣道內分泌物堵塞管腔，引流不暢又會加重感染[13-14]。一項Meta 觀察性隊列研究結果顯示，合并銅綠假單胞菌感染的支氣擴張患者，其病情嚴重度指標及生活質量均差于未合并感染者[15]，這可能與銅綠假單胞菌感染導致的炎癥反應有關。

本研究發現，支氣管擴張患者合并銅綠假單胞菌感染患者外周血單個核細胞中HMGB1、RAGE蛋白水平高于健康對照組，提示HMGB1、RAGE 參與了炎癥反應。據分析，銅綠假單胞菌持續定植引起支氣管內皮細胞壞死，可能導致HMGB1活化，而RAGE 作為其受體，可以通過作用多種炎性細胞上核因子κB核轉位，進一步促進炎性細胞因子的釋放引起炎性器官損傷[16]。

支氣管肺泡灌洗在對呼吸道分泌物清理以提高通暢程度的同時誘發咳嗽，促進痰液及炎性物質的吸收，有利于病灶的吸收[17-18]。本研究結果顯示，研究組（A組和B組）患者經過灌洗治療，患者的炎癥反應得到改善，其外周血單個核細胞及肺泡灌洗液中HMGB1、RAGE 蛋白水平降低；外周血及肺泡灌洗液中Th17細胞占比降低，Treg細胞占比升高；外周血及肺泡灌洗液中IL-17、IL-6水平降低，TGF-β1、IL-10水平升高。B組患者在A組基礎上給予參芪扶正注射液輔助治療，其上述炎癥細胞因子變化更顯著。

上述結果表明，參芪扶正注射液可改善支氣管擴張癥伴銅綠假單胞菌感染患者炎癥狀況，可能與其影響HMGB1 通路、Th17/Treg 免疫平衡有關。在肺泡灌洗術治療的基礎上聯合參芪扶正注射液治療支氣管擴張癥伴銅綠假單胞菌感染，能取得更好效果，值得臨床進一步探討。