雙酶法制備羊棲菜多肽的工藝研究

◎ 李愛英，馮秀靜，龐庭才

（1.崇左幼兒師范高等專科學(xué)校，廣西 崇左 532200；2.北部灣大學(xué)，廣西 欽州 535000）

羊棲菜（Sargassum fusiforme），別名海大麥[1]，屬于海洋藻類植物，藻體黃褐色，肥厚多汁。羊棲菜營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種對(duì)人體有益的微量元素和某些特殊的生物特性，長(zhǎng)期食用能使人的皮膚光滑滋潤(rùn)，羊棲菜中的多糖對(duì)腫瘤具有免疫力[2]，能促進(jìn)造血功能和防止高血壓[3]，適量食用羊棲菜可改善咽喉腫痛、口舌生瘡的癥狀。

我國(guó)的羊棲菜雖然資源豐富，但是由于新鮮的羊棲菜不利于長(zhǎng)期儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，因此不能滿足消費(fèi)者的需求，為了充分利用羊棲菜豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用價(jià)值，將羊棲菜的蛋白質(zhì)提取出來(lái)并通過(guò)甲醛滴定法[5-7]測(cè)定其水解度，研制出精深加工的營(yíng)養(yǎng)保健酒品[8-9]，力求最大限度地利用其營(yíng)養(yǎng)成分，擴(kuò)大消費(fèi)區(qū)域，滿足全國(guó)人們不斷增長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜，廣東雷州半島2015年所產(chǎn)；標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉、中性甲醛溶液、百里酚酞、中性紅指示劑，廣州凱爾化工科技有限公司；堿性蛋白酶（20萬(wàn)U·g-1）、木瓜蛋白酶（6萬(wàn)U·g-1），南寧東恒華道生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超高速多功能粉碎機(jī)，市康市善竹貿(mào)易有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；磁力攪拌器，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藻蛋白水解的工藝流程

藻蛋白水解的工藝流程：曬干的羊棲菜用自來(lái)水浸泡0.5~1 h→清洗→石油醚回流→粉碎、過(guò)篩、浸提→離心、沉淀→成品羊棲菜蛋白→雙酶水解藻蛋白。

1.3.2 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法[4]測(cè)定水解度。水解度（Degree of Hydrolysis，DH）計(jì)算公式如下所示：

式中：C-NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；V-酶解液消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積， mL；V0-未酶解液（空白）消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；0.014-氮毫克當(dāng)量；N-底物樣品總氮含量，g。

1.3.3 單酶和雙酶分別對(duì)羊棲菜蛋白水解度大小的比較

取同質(zhì)量的羊棲菜蛋白質(zhì)溶于蒸餾水，分別加入單酶（堿性蛋白酶/木瓜蛋白酶），并使用雙酶法A和雙酶法B處理羊棲菜蛋白，以水解度大小為指標(biāo)進(jìn)行比較試驗(yàn)。

1.3.4 單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)不同因素對(duì)水解度的影響，選取水解溫度、時(shí)間、pH、酶底比4個(gè)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)[8]。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從4個(gè)單因素中選出條件最佳，以酶底比A、溫度B、pHC、時(shí)間D為自變量，水解度為響應(yīng)面值，采用4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化，見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶和雙酶對(duì)羊棲菜蛋白水解度大小的比較結(jié)果

由表2可知，雙酶法B水解羊棲菜蛋白所得的水解度最高，說(shuō)明雙酶法比單酶法效果更好。對(duì)雙酶法的比例進(jìn)一步探究，且由表3可知，兩種酶比例為1∶1時(shí)，水解效果更好。根據(jù)酶具有專一性的特點(diǎn)進(jìn)行分析，第二種酶是利用第一種酶水解后的產(chǎn)物進(jìn)行水解，第二種酶對(duì)前一種酶未水解完全的羊棲菜蛋白進(jìn)行水解，不同的酶對(duì)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方式不同，這都會(huì)使蛋白水解度得到提高，使羊棲菜蛋白水解更加徹底。

表2 酶量的確定表

表3 雙酶法的用量確定表

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 酶與底物濃度的比例對(duì)水解程度的影響

由圖1可知，隨著酶與底物濃度的上升水解度愈加明顯，酶底比為4%增加到8%時(shí)水解度變化不明顯，原因是提取液基本達(dá)到飽和。當(dāng)酶底比大于8%時(shí)，水解度呈下降趨勢(shì)。

圖1 酶與底物濃度的比例對(duì)水解程度的影響圖

2.2.2 溫度對(duì)水解度的影響

由圖2可知，水解度隨著溫度的升高而升高，到達(dá)一定溫度時(shí)水解度降低。溫度從50 ℃增加到60 ℃時(shí)水解度明顯大幅提高，說(shuō)明加熱能使化學(xué)反應(yīng)速率加快。在60 ℃時(shí)水解度達(dá)到最高值41.32%。當(dāng)溫度從60 ℃到70 ℃時(shí)，水解度大幅度下降。

圖2 溫度對(duì)水解度的影響

2.2.3 pH對(duì)水解度的影響

由圖3可知，隨著pH的變化，水解度先提高后降低，當(dāng)pH由5.5增加到6.5時(shí)，水解度達(dá)到最大值26.78%。當(dāng)pH大于6.5時(shí)，水解度呈大幅度下降，原因可能是偏堿性環(huán)境下使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，酶的活力部位處于離解狀態(tài)，因此影響到酶與底物的結(jié)合。

圖3 pH對(duì)水解度的影響圖

2.2.4 時(shí)間對(duì)水解程度的影響

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度先提高后緩慢降低，原因可能是部分底物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，部分酶失活，影響了酶解效果，當(dāng)酶解時(shí)間為180 min時(shí)水解度達(dá)到最大值42.56%，酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，水解度小幅度降低，由42.56%變化到37.62%。

圖4 時(shí)間對(duì)水解程度的影響

3 時(shí)間對(duì)水解程度的影響

3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

3.1.1 響應(yīng)面結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken模型，以酶與底物比例A，水解溫度B，pH值C和水解時(shí)間D4個(gè)因素為自變量，并以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平，對(duì)自變量進(jìn)行編碼，水解度為響應(yīng)面Y值。通過(guò)軟件Design-Expert對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果表

3.1.2 回歸方程擬合及方差分析

軟件Design-Expert對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，擬合得到回歸方程為：Y=41.56-0.33A+1.04B+0.74C-0.17D+0.47AB+0.017AC+0.39AD+0.063BC+0.095BD-0.81CD-0.50A2-1.80B2-1.68C2-2.12D2。

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)雙酶法水解羊棲菜蛋白的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，模型一次項(xiàng)B影響極其顯著（P<0.01），一次項(xiàng)C影響顯著（P<0.05）；一次項(xiàng)A、D因素對(duì)水解度大小影響均不夠顯著。溫度對(duì)水解度大小的影響極其顯著；水解溫度、時(shí)間和pH的二次項(xiàng)對(duì)水解度大小比較顯著；二次交互項(xiàng)是不夠顯著的，由此可進(jìn)行分析預(yù)測(cè)：時(shí)間、溫度、pH3個(gè)因素的交互項(xiàng)對(duì)雙酶水解羊棲菜蛋白水解度的影響顯著，各因素之間有交互作用[10]。從表5可以看出，各因素對(duì)羊棲菜蛋白水解度大小的影響排列順序?yàn)樗鉁囟龋緋H＞酶底比＞水解時(shí)間。

表5 二次響應(yīng)面回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表

模型P=0.018 4＜0.05，這表明二次方差模擬顯著，對(duì)于回歸方程的失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P=0.067 6，不顯著，這說(shuō)明試驗(yàn)因數(shù)外的未知量干擾不大。回歸方程的負(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.879，說(shuō)明響應(yīng)面的回歸關(guān)系顯著，表明回歸方程與試驗(yàn)情況擬合較好。說(shuō)明了響應(yīng)面回歸方程能預(yù)測(cè)雙酶水解羊棲菜蛋白水解度的變化，反映了水解度與pH、酶底比、溫度和時(shí)間存在密切的關(guān)系。

3.1.3 響應(yīng)面圖分析

由響應(yīng)面圖分析結(jié)論可知，羊棲菜蛋白質(zhì)水解的最佳參數(shù)為酶底比6%,水解的溫度60 ℃，pH為6.5，時(shí)間195 min。

3.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)

將響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)修正后，實(shí)際的操作條件為酶底比6%,水解的溫度60 ℃，pH為6.5，時(shí)間180 min。實(shí)際測(cè)得羊棲菜蛋白質(zhì)的水解度為41.73%，與模型預(yù)測(cè)值相近。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，羊棲菜蛋白的水解度為41.73%，與理論值41.82%的誤差0.09%。驗(yàn)證了回歸模型預(yù)測(cè)個(gè)因素與提取率之間關(guān)系的可靠性。

4 結(jié)論與分析

本文通過(guò)因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析方法，對(duì)羊棲菜多肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，通過(guò)軟件Design-Expert的回歸模型得出最佳的工藝制備條件理論值為：水解溫度61.29 ℃、水解pH 6.62、水解酶底比5.76%、水解時(shí)間180 min、水解度為41.829 5%。考慮到實(shí)際操作過(guò)程的限制條件，在驗(yàn)證試驗(yàn)中把制備羊棲菜多肽的最佳工藝條件設(shè)為溫度60 ℃、水解pH 6.5、水解酶底比6 %、水解時(shí)間180 min，羊棲菜蛋白液的水解度為41.73%，與理論值誤差0.099 5%。各因素對(duì)羊棲菜蛋白水解度大小的影響排列順序?yàn)樗鉁囟龋緋H＞酶底比＞水解時(shí)間。這說(shuō)明影響酶活力的因素很多，其主要因素有溫度、pH和底物濃度，次要因素有時(shí)間和金屬離子等，這些因素通過(guò)破壞酶的空間結(jié)構(gòu)和影響活性部位結(jié)合基團(tuán)，使酶失去活性，或是通過(guò)破壞底物（蛋白質(zhì)）的空間結(jié)構(gòu)，使底物不能分解產(chǎn)物與底物進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)。由于水解度的提高也會(huì)使羊棲菜蛋白轉(zhuǎn)化為小分子多肽的概率提高，肽的產(chǎn)率也相應(yīng)增加，為提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用成分，并為進(jìn)一步研制營(yíng)養(yǎng)保健品或其他精深加工產(chǎn)品提供了途徑。