高效液相色譜法同時測定小兒消積通便顆粒中5-羥甲基糠醛等9種有效成分的含量

馬國平，周洪亮，范智毅，趙霞，劉志輝作者單位：南京中醫藥大學附屬醫院藥學部，江蘇 南京009；南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 003

兒童功能性便秘是由多種因素引起的以糞便硬結、持續排便困難、排便次數減少等為主要癥狀的功能性腸胃疾病，是兒童最常見的消化道功能紊亂疾病之一。小兒消積通便方為江蘇省中醫院趙霞主任根據小兒的生理病理特點及兒童功能性便秘的病因病機自擬的臨床經驗方，本方由炒枳實、姜厚樸、炒白術、火麻仁、炒決明子、炒雞內金、焦山楂、連翹和胡黃連組成。其中，炒枳實消食導滯為君，姜厚樸理氣除滿為臣，佐以炒白術健脾和胃，火麻仁、決明子潤腸通便，炒雞內金、焦山楂健胃消食，連翹清熱散結，胡黃連燥濕消積，共奏消食化積，潤腸通便之功，主要用于小兒食積便秘的干預和治療，臨床應用十數年，療效顯著。

本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對小兒消積通便顆粒中5-羥甲基糠醛、連翹苷、連翹酯苷A、胡黃連Ⅰ、胡黃連Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、橙黃決明素、厚樸酚的含量進行研究，為其質量標準的制訂提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（主機：1100 型，檢測器：G1314A 型紫外檢測器，美國Aglient 科技有限公司）；Sartorius BP-211D 電子分析天平（賽多利斯公司）；SK6200H 超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）；Milli-Q純水儀（密理博科技有限公司）。

1.2 試藥

小兒消積通便顆粒由江蘇省中醫院生產（批號190220，190221，190222）；橙黃決明素（純度≥89.9%，批號111900-201303，中國食品藥品檢定研究院）；5-羥甲基糠醛（批號160512），連翹酯苷A（批號181110），胡黃連苷Ⅱ（批號181107），柚皮苷（批號181119），橙皮苷（批號181106），胡黃連苷Ⅰ（批號180602），連翹苷（批號190103），厚樸酚（批號181105）均購自南京聚康醫藥化工有限公司，純度≥98%；陰性制劑（除不加各組方藥材外，制備方法同小兒消積通便顆粒）由實驗室制備；乙腈（色譜純，美國TEDIA有限公司），超純水（自制）。

2 方法與結果

2.1 對照品、供試品及陰性溶液的制備

精密稱取對照品適量，加甲醇制成每毫升分別含5-羥甲基糠醛、連翹苷、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、橙黃決明素、厚樸酚190.00 μg、46.55 μg、108.70 μg、26.18 μg、22.50 μg、43.18 μg、91.09 μg、19.50 μg、39.55 μg的混合對照品溶液，備用。

取小兒消積通便顆粒約0.35 g，精密稱定，置25 mL 帶塞錐形瓶中，加入70% 甲醇10 mL，精密稱定，超聲30 min（功率280 W，頻率53 kHz），冷卻至室溫，加70% 甲醇補足失重，搖勻，微孔濾膜濾過（0.45 μm），取續濾液，即得。

分別取缺胡黃連、焦山楂、姜厚樸、炒決明子、炒枳實、連翹的陰性制劑，制備方法同供試品溶液，分別制得各陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.2%磷酸-水溶液（A）-乙腈（B），按表1 進行梯度洗脫；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm。

表1 梯度洗脫表/%

2.3 系統適用性試驗

分別吸取對照品溶液、小兒消積通便顆粒供試品溶液及小兒消積通便顆粒陰性供試品溶液，按“2.2”項下的條件進行進樣，得HPLC 色圖譜，見圖1。由圖1A 可得，各有效成分保留時間分別為1 號峰：5-羥甲基糠醛（12.640 min），2號峰：連翹酯苷A（35.968 min），3 號峰：胡黃連苷Ⅱ（36.956 min），4 號峰：柚皮苷（43.290 min），5 號峰：橙皮苷（44.916 min），6 號峰：胡黃連苷Ⅰ（48.259 min），7號峰：連翹苷（60.807 min），8號峰：橙黃決明素（77.655 min），9 號峰：厚樸酚（86.683 min）。供試品與對照品在相同位置有吸收，陰性供試品無干擾。

圖1 小兒消積通便顆粒混合對照品、供試品及各陰性樣品色譜圖：A 為混合對照品；B為供試品；C為缺胡黃連陰性樣品；D為缺焦山楂陰性樣品；E為缺姜厚樸陰性樣品；F為缺炒決明子陰性樣品；G為缺炒枳實陰性樣品；H為缺連翹陰性樣品

2.4 方法學考察

2.4.1

線性關系 精密吸取“2.1”項下的混合對照品溶液適量，分別加入甲醇稀釋成2、4、10、20、40倍的混合對照品溶液，按“2.2”項下的條件進行含量測定。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程結果見表2。

表2 線性回歸方程、線性范圍及相關系數（r）

2.4.2

精密度試驗 取稀釋2倍的混合對照品溶液，重復進樣6 次，測定，計算，5-羥甲基糠醛、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黃連苷Ⅰ、連翹苷、橙黃決明素、厚樸酚的峰面積相對標準偏差（RSD）為0.13%、0.38%、0.28%、0.44%、0.37%、0.61%、0.67%、0.45%、0.43%。結果表明，儀器精密度良好。

2.4.3

重復性試驗 取190222 批小兒消積通便顆粒，分別精密稱定約0.35g，共6份，依照“2.1”項下方法制備小兒消積通便顆粒供試品，按“2.2”項下的條件進行測定，計算。5-羥甲基糠醛、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黃連苷Ⅰ、連翹苷、橙黃決明素、厚樸酚的含量分別為158.15 μg/g、271.29 μg/g、43.18 μg/g、14.24 μg/g、171.56 μg/g、58.91 μg/g、25.47 μg/g、2.98 μg/g、9.21 μg/g；RSD分 別 為0.41%、0.32%、1.03%、2.34%、0.50%、0.54%、2.63%、2.60%、2.50%。結果表明，該方法重復性良好。

續圖1 小兒消積通便顆粒混合對照品、供試品及各陰性樣品色譜圖：A為混合對照品；B為供試品；C為缺胡黃連陰性樣品；D為缺焦山楂陰性樣品；E為缺姜厚樸陰性樣品；F為缺炒決明子陰性樣品；G為缺炒枳實陰性樣品；H為缺連翹陰性樣品

2.4.4

穩定性試驗 取同一供試品溶液，依法分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，計算。5-羥甲基糠醛、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黃連苷Ⅰ、連翹苷、橙黃決明素、厚樸酚的峰面積RSD 為0.18%、0.25%、1.09%、1.82%、0.95%、0.56%、1.99%、1.60%、2.71%。結果表明，該供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.4.5

加樣回收率試驗 稱取已知含量的小兒消積通便顆粒（190222批）約0.175 g，共6份，分別精密加入等量對照品，依“2.1”項下的操作制備小兒消積通便顆粒供試品溶液，測定，計算。結果見表3。試驗結果表明，該方法準確性良好。

表3 加樣回收率試驗表（n=6）

續表3 加樣回收率試驗表（n=6）

2.4.6

含量測定 分別稱取小兒消積通便顆粒3批各0.35 g，精密稱定，照“2.1”項下操作制備小兒消積通便顆粒供試品溶液，按“2.2”項下條件測定，計算。結果見表4。

表4 3批樣品每袋的含量/（μg/g）

3 討論

小兒消積通便顆粒由炒枳實、姜厚樸、炒白術、火麻仁、炒決明子、炒雞內金、焦山楂、連翹和胡黃連組成。炒枳實為君藥，其黃酮類成分柚皮苷和橙皮苷是理氣、行滯、抗炎抗氧化的重要活性成分；姜厚樸為臣藥，其特征性成分厚樸酚可劑量依賴性增加回腸縱行肌收縮頻率和振幅，改善胃腸運動障礙和抗腹瀉；胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ、連翹中的連翹酯苷A 和連翹苷、決明子中的橙黃決明素和焦山楂中的5-羥甲基糠醛具有抗菌消炎、抗氧化的作用；故將上述活性成分作為小兒消積通便顆粒的指標成分進行含量測定，可對其質量進行更全面的控制。

小兒消積通便顆粒含量測定方法研究過程中發現：柱溫對胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的分離度有一定影響，柱溫在20～30 ℃內時對胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ變化較小，故擇常規柱溫25 ℃作為檢測柱溫。檢測波長的選擇上，連翹、胡黃連、枳實中的成分檢測波長均在270 nm左右，故選擇270 nm為檢測波長。本實驗還比較了不同流動相、不同分析時間等對色譜圖的影響，發現以0.2% 磷酸水作為流動相，可改善連翹酯苷、胡黃連苷Ⅱ、橙皮苷等成分的峰形，故選擇0.2% 的磷酸水溶液作為流動相。由于本研究涉及9 種成分的定量研究，分析時間對各峰的分離效果影響很大，前期實驗嘗試了多種梯度條件均未能在短時間內獲得較好的分離效果，而最終確定的色譜條件則兼顧了分離效果與分析時間。

方法學考察表明，該方法重復性好、專屬性強，可為小兒消積通便顆粒質量標準的建立提供參考，同時還可為其醫療機構制劑工藝過程研究與控制、穩定性研究等奠定基礎。