微小RNA-374a靶向脾酪氨酸激酶對卵巢癌細胞放射敏感性及遷移、侵襲的影響

李娜，榮金鳳，徐艷

卵巢癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其早期發病較為隱匿且極易出現擴散及轉移，調查顯示卵巢癌病人5年生存率較低。目前臨床采用手術結合放化療等手段治療卵巢癌，但腫瘤細胞對放射治療極易產生耐受性而降低治療效果。因而如何提高腫瘤細胞放射敏感性成為重點研究問題。miRNA 異常表達可通過誘導細胞凋亡而增強腫瘤細胞放射敏感性。因而積極尋找與卵巢癌發生及轉移相關的分子靶點對提高細胞放射敏感性具有重要意義。研究表明微小RNA-374a（miR-374a）在卵巢癌中上調表達并可降低細胞對順鉑的敏感性。但miR-374a對卵巢癌放射敏感性的影響尚未可知。TargetScan預測顯示脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）可能是miR-374a 的靶基因，研究表明Syk 低表達與卵巢癌病人臨床病理特征相關。本研究探討miR-374a 對卵巢癌細胞遷移及侵襲的影響及其與放射敏感性的關系，初步分析miR-374a 對Syk 的靶向調控作用，試圖闡明miR-374a 在卵巢癌發展及治療中的作用機制，旨在為卵巢癌放射治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2017年2月至2018年1月在宜賓市第二人民醫院接受治療的63 例卵巢癌病人為研究對象，所有病人均接受手術切除治療。以卵巢癌癌旁組織為對照，術中切除卵巢癌組織及癌旁組織，病人年齡（65.85±3.87）歲，范圍為50～70 歲。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，入組病人知情且簽署同意書。

1.2 材料與試劑

卵巢癌A2780 細胞購自美國ATCC 公司。Trizol 試劑購自北京嘉美紐諾生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；miR-374a特異性寡核苷酸抑制劑（antimiR-374a）及陰性對照（anti-miR-NC）、Syk 小干擾RNA（si-Syk）與陰性對照si-NC 均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自美國Thermo Fisher 公司；Transwell 小室與Matrigel 基質膠均購自美國BD公司；噻唑藍（MTT）細胞增殖檢測試劑盒購自上海基爾頓生物科技有限公司；兔抗人細胞周期蛋白1（cyclin D1）、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（cell cycle dependent protein kinase inhibitor 1A，P21）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）購自上海碧云天生物技術有限公司；上皮鈣黏素（E-cadherin）抗體購自美國R&D Systems 公司；逆轉錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1

實驗處理與分組 A2780細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養。培養箱環境條件為37 ℃、5% 二氧化碳體積分數、相對濕度95%。細胞80% 融合時進行傳代培養。收集對數生長期細胞進行轉染，以隨機數字表法分成anti-miR-NC 組（細胞中轉染anti-miR-NC）、anti-miR-374a 組（細胞中轉染anti-miR-374a）、anti-miR-374a+si-NC 組（細胞中共轉染anti-miR-374a 與si-NC）、anti-miR-374a+si-Syk 組（細胞中共轉染anti-miR-374a 與si-Syk），轉染步驟參照Lipofectamine2000 說明書。收集轉染48 h細胞進行后續實驗。

1.3.2

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測miR-374a 表達 取凍存卵巢癌及癌旁組織冰上溶解，分別加入Trizol 試劑提取總RNA（各組卵巢癌A2780 細胞復蘇后加入Trizol 試劑），利用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA 濃度，加入無核糖核酸酶水稀釋RNA（50 mg/L），參照逆轉錄試劑盒合成互補DNA（cDNA），據SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒配置反應體系進行qRT-PCR。2算法計算miR-374a相對表達量。

1.3.3

MTT 法檢測細胞增殖 取對數生長期A2780細胞接種于96孔板（3×10個/孔），分別于轉染24 h、48 h、72 h 時向各孔添加20 μL MTT 溶液，孵育4 h后，棄上清，依次150 μL 二甲基亞砜，低速振蕩至結晶溶解。酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度。

1.3.4

Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲 侵襲實驗：將稀釋的Matrigel平鋪于上室，置于37 ℃恒溫培養箱孵育5 h，取各組A2780 細胞接種于上室（5×10個/孔），取600 μL含血清培養液接種下室。孵育24 h后，多聚甲醛固侵襲細胞，結晶紫染液染色。顯微鏡下計數侵襲細胞數。以未經Matrigel 基質膠包裹的小室進行遷移實驗，其余步驟參考侵襲實驗。

1.3.5

克隆形成實驗檢測細胞敏感性 anti-miRNC 組、anti-miR-374a 組、anti-miR-374a+si-NC 組、anti-miR-374a+si-Syk 組細胞經0、2、4、6、8 Gy 照射劑量射線照射（劑量率0.36 Gy/min），收集放射處理的細胞，0.25% 胰蛋白酶消化細胞，計數后接種于24孔培養皿中（3×10個/毫升），分別加入DMEM 培養基，置于37 ℃恒溫培養箱內培養10～15 d，棄培養液，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌，甲醇固定后進行結晶紫染色。計算細胞存活分數，參照單擊多靶模型計算細胞放射增敏比。

1.3.6

雙熒光素酶報告基因實驗 將含有結合位點Syk 的3’非翻譯區（UTR）序列及突變位點的Syk的3’UTR 序列別插入pGL3 載體分別構建成WTSyk、MUT-Syk 重組載體，分別將重組載體與miR-374a mimics、miR-NC 共轉染至卵巢癌A2780 細胞，實驗分組分成miR-NC 組（WT-Syk）、miR-374a 組（WT-Syk）、miR-NC 組（MUT-Syk）、miR-374a 組（MUT-Syk），收集培養48 h細胞檢測熒光素酶活性。

1.3.7

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測Syk、cyclin D1、MMP-2、P21、E-cadherin 蛋白表達 提取A2780 細胞總蛋白，按照蛋白變性→十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉聚偏二氟乙烯膜→封閉膜→一抗稀釋液（1∶1000）孵育→二抗稀釋液（1∶2000）孵育→化學發光顯色步驟進行。ImageJ 軟件分析各條帶相對于內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）條帶灰度值。

2 結果

2.1 miR-374a 在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達

卵巢癌組織中miR-374a 的表達水平（0.92±0.09）高于癌旁組織（0.28±0.03）（

t

=53.546，

P

＜0.001）。

2.2 抑制miR-374a 表達對細胞A2780 生物學行為及放射敏感性的影響

anti-miR-374a 組卵巢癌A2780 細胞遷移與侵襲數、cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達、增殖活力低于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表達水平高于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），見圖1、圖2、表1、表2。anti-miR-374a 組卵巢癌A2780 細胞存活分數低于anti-miR-NC 組（

P

＜0.05），增敏比明顯高于anti-miR-NC組，見表3，4。

圖2 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

表1 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖的影響/±s

表2 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780遷移、侵襲的影響/±s

表3 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780存活分數的影響/±s

圖1 抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780遷移、侵襲的影響（結晶紫染色×200）

2.3 miR-374a 靶向、調控Syk

TargetScan 預測顯示Syk 的3’UTR 含有miR-374a 的結合位點，見圖3。與miR-NC 組（WT-Syk）比較（0.99±0.10），miR-374a組（WT-Syk）熒光素酶活性降低（0.22±0.02）（

t

=18.495，

P

＜0.001）；而miR-NC 組（MUT-Syk）（1.03±0.10）熒光素酶活性與miR-374a 組（MUT-Syk）（0.96±0.10）比較差異無統計學意義（

t

=1.212，

P

=0.253）。

圖3 TargetScan預測脾酪氨酸激酶（Syk）的3’UTR與miR-374a的結合位點

表4 細胞放射增敏比單擊多靶模型參數

miR-NC 組、miR-374a 組、anti-miR-NC 組、antimiR-374a 組卵巢癌A2780 細胞中Syk 的表達水平比較差異有統計學意義（

F

=294.889，

P

＜0.001），miR-374a 組（0.07±0.01）低于miR-NC 組（0.26±0.02）（

P

＜0.05），anti-miR-374a組（0.63±0.06）高于anti-miR-NC組（0.25±0.02）（

P

＜0.05），見圖4。

圖4 過表達miR-374a或抑制miR-374a表達對Syk蛋白表達的影響

2.4 抑制Syk 表達能逆轉抑制miR-374a 表達對細胞A2780 放射敏感性的影響

相較于anti-miR-374a+si-NC 組，anti-miR-374a+si-Syk 組卵巢癌A2780 細胞存活分數升高（

P

＜0.05），增敏比明顯降低，見表5，6。

表5 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780存活分數的影響/±s

表6 細胞放射增敏比單擊多靶模型參數

2.5 抑制Syk 表達能逆轉抑制miR-374a 表達對細胞A2780 生物學行為的影響

anti-miR-374a+si-Syk組卵巢癌A2780 細胞活力、cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達、遷移與侵襲數高于anti-miR-374a+si-NC 組（

P

＜0.05），P21 和E-cadherin 蛋白表達低于anti-miR-374a+si-NC組（

P

＜0.05），見圖5、表7、表8。

表7 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖的影響/±s

表8 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780遷移、侵襲的影響/±s

圖5 抑制Syk表達能逆轉抑制miR-374a表達對卵巢癌細胞A2780增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討論

卵巢癌病人在治療期間易出現耐藥、轉移等導致病人預后不良，但關于卵巢癌發病機制仍需深入研究。卵巢癌晚期病人主要采用放療進行治療，其主要通過抑制或殺傷腫瘤細胞而發揮作用，但治療過程中病人常出現輻射敏感等現象，進一步研究顯示miRNA 表達水平與腫瘤細胞生長及治療密切相關。但miRNA 在卵巢癌細胞放射抵抗中的調控作用尚未完全闡明。

miR-374a 在非小細胞肺癌病人血清中的表達水平升高，并可能成為臨床診斷非小細胞肺癌的輔助指標。研究表明miR-374a 高表達與宮頸癌病人淋巴結轉移等臨床病理特征有關。miR-374a-5p可通過靶向SPIN1而降低食管鱗狀細胞癌對放療的敏感性。本研究結果顯示miR-374a 在卵巢癌組織中的表達水平高于癌旁組織，抑制miR-374a 表達可提高卵巢癌細胞對放射的敏感性。進一步研究顯示抑制miR-374a 表達可降低卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，通過蛋白質印跡法證實抑制miR-374a 表達可促進P21、E-cadherin 表達，抑制cyclin D1、MMP-2 表達，另有研究報道指出cyclin D1 可通過與CDK 結合形成復合物進而調控細胞增殖及分裂導致腫瘤發生，P21 可抑制cyclin D1 與CDK 結合形成復合物從而抑制腫瘤細胞惡性進展。研究表明MMP-2 在卵巢癌組織中高表達并可促進細胞遷移及侵襲，E-cadherin 表達減少可促進腫瘤細胞浸潤擴散。本研究證實抑制miR-374a 表達可減弱卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。

Syk基因可調控B淋巴細胞的多種生物學過程，研究表明Syk 基因在結腸癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中呈低表達，并可在腫瘤發生發展過程中發揮抑癌基因作用。Syk可改變膠質瘤微環境，影響膠質瘤細胞增殖及遷移。本研究試圖分析miR-374a 與Syk 在卵巢癌細胞生長、轉移及放射敏感性中的作用關系，結果表明miR-374a 可負向調控Syk的表達，且聯合抑制miR-374a和Syk表達后，卵巢癌細胞活力增強，遷移與侵襲細胞數增多，提示miR-374a 通過靶向Syk 來抑制卵巢癌細胞生物學行為，增強細胞放射敏感性。

綜上，miR-374a 表達水平降低可增強卵巢癌細胞放射敏感性，其作用機制可能是通過上調Syk 表達降低卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲能力而實現，可為卵巢癌放射治療提供新方向。

（本文圖1見插圖12-3）