微小RNA-7-5p靶向調節鋅指蛋白核轉錄因子4基因抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和誘導凋亡的體外研究

尚念紅

口腔癌是最常見的頭頸癌類型，口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔癌總數的約90%，全世界每年診斷出新病例超過30萬。雖然OSCC 的診斷和臨床治療方面取得了一定進步，但OSCC 病人的5年總生存率無顯著提高，仍然小于50%。因此，探究OSCC發生和進展的分子機制對于鑒定新的、有效治療靶標是必不可少的。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性、小的非編碼RNA分子，長度約為22個核苷酸。它們通過與靶mRNA 的3′非翻譯區（3′-UTR）中的互補序列結合并調節轉錄后或翻譯水平的基因表達來影響腫瘤的生物學過程。目前已證明多種miRNA 參與OSCC 的生理和病理過程，包括細胞增殖、凋亡、遷移、代謝和分化。例如，如miR-133a-3p 在OSCC 中的表達降低并充當腫瘤抑制因子，miR-196a-5p 在OSCC 細胞凋亡中起關鍵作用，miR-361-5p表達下調與淋巴結轉移和OSCC預后不良。這些發現支持miRNA 在口腔腫瘤發生和進展中的起關鍵作用。近期研究發現，與正常健康組織相比，OSCC 組織中miR-7-5p 的表達量明顯下調。miR-7-5p 在人類幾種癌癥類型中異常表達，包括非小細胞肺癌、結直腸癌和食管鱗狀細胞癌。然而，miR-7-5p 在人OSCC 中的潛在作用和作用機制仍有待確定。因此本實驗旨在探究miR-7-5p 對OSCC 細胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機制，研究起止時間為2018年3—10月。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常口腔黏膜成纖維細胞株hOMF由上海艾研生物科技有限公司提供；OSCC 細胞株SCC25、Cal127 和Tca8113 由美國ATCC 細胞庫提供；RPMI 1640 培養基由美國Hyclone 公司提供；胎牛血清、Lipofectamine 2000 轉染試劑由美國Invitrogen公司提供；miR-7-5p模擬物（miR-7-5p mimics）及陰性對照序列（mimics Control）由廣州銳博生物科技有限公司提供；Trizol 試劑、反轉錄試劑盒由賽默飛世爾公司提供；SYBR Primix Ex Taq 檢測試劑盒由日本TaKaRa公司提供；噻唑藍（MTT）試劑由美國Sigma 公司提供；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒由大連TaKaRa公司提供；RIPA 細胞裂解液、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、蛋白發光液均由上海碧云天生物技術研究所提供；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜由美國Millipore 公司提供；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒由美國Promega 公司提供；鋅指蛋白核轉錄因子4（KLF4）3′-UTR 野生型（KLF4-Wt）和KLF43′-UTR 突變型（KLF4-Mut）熒光素酶重組載體質粒由廣州輝駿生物科技有限公司提供；KLF4 抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體由美國Abcam 公司提供；辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（IgG）由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.2 細胞培養

OSCC細胞SCC25、Cal127、Tca8113及正常口腔黏膜成纖維細胞hOMF 均培養在含10%胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，置5%二氧化碳、37 ℃培養箱中進行培養。使用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，待細胞鋪滿瓶底90% 時用胰蛋白酶消化細胞，以1∶3 比例進行傳代，取處對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3 細胞轉染及分組

將OSCC細胞SCC25接種到細胞培養板中，過夜培養，待細胞融合度為50% 時，使用脂質體Lipofectamine 2000 轉染試劑將miR-7-5p mimics（終濃度為50 nmol/L）及mimics Control（終濃度為50 nmol/L）分別轉染至SCC25 細胞。實驗分為三組：Control組（未轉染的SCC25細胞）、NC組（轉染mimics Control 的SCC25 細胞）、miR-7-5p 組（轉染miR-7-5p mimics 的SCC25 細胞）。轉染6 h 時更換新的培養液，于37 ℃培養箱繼續培養。

1.4 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測

分別采用Trizol 法提取OSCC 細胞SCC25、Cal127、Tca8113 及正常口腔黏膜成纖維細胞hOMF 中總RNA，提取轉染48 h 后各組SCC25 細胞中總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書配制反應體系，并合成第一鏈互補DNA（cDNA），然后使用SYBR Primix Ex Taq 檢測試劑盒以cDNA 為模板，進行qRT-PCR 檢測。以U6 為內參，分析細胞中miR-7-5p mRNA 相對表達量，擴增條件設置為：95 ℃5 min，95 ℃20 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，共設40個循環，以相對量2法進行計算。采用同樣的方法分析轉染48 h 后各組SCC25 細胞中KLF4 mRNA 相對表達量。

1.5 MTT 法檢測

分別將轉染24、48、72 h 后各組SCC25 細胞種植到96 孔板中，每組細胞在各個時間點設置3個復孔，向每孔細胞中加入濃度為5 g/L 的MTT 溶液20 μL，37 ℃繼續培養4 h，取出細胞培養板，棄去上清培養液，再向細胞中加入150 μL 二甲基亞砜溶液，混勻后繼續孵育30 min，使用酶標儀檢測各孔細胞450 nm波長處吸光度，實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

分別收集轉染48 h 后各組SCC25 細胞，約為1×10個細胞，以PBS洗滌2 次，向細胞中加入100 μL Bingding Buffer 結合緩沖液重懸細胞，向細胞懸液中加入Annexin VFITC 試劑10 μL，輕輕混勻，在室溫下避光反應15 min，離心收集細胞，再加入預冷的PBS重懸細胞，再向細胞懸液中加入PI 染液10 μL，避光孵育5 min，在流式細胞儀上檢測各組SCC25細胞凋亡情況。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

TargetScan 等生物信息學預測軟件預測結果顯示，KLF43′-UTR 存在與miR-7-5p 靶向結合的位點，提示KLF4 可能是miR-7-5p 直接靶基因。根據預測結果分別構建KLF4-Wt載體質粒和KLF4-Mut載體質粒，該部分由廣州輝駿生物科技有限公司完成。將KLF4-Wt 和KLF4-Mut 載體質粒分別與miR-7-5p mimics 或mimics Control 共轉染至SCC25 細胞，每組設6個復孔，轉染48 h 后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計算各組細胞相對熒光活性。

1.8 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測

收集轉染48 h 后各組SCC25 細胞，加入RIPA 細胞裂解液，在冰上裂解提取細胞中總蛋白，使用BCA 檢測試劑盒對蛋白樣品進行定量檢測，取40 μg 蛋白樣品行SDS-PAGE 電泳，電轉至PVDF 膜上，將膜置于5% 脫脂奶粉中封阻1 h，PBST 洗膜3 次，然后加入1∶1000 稀釋的KLF4 一抗，4 ℃過夜雜交，PBST 洗膜3 次，加入1∶3000 稀釋的二抗，室溫雜交2 h，PBST洗膜3 次，加入ECL 發光液，顯影、成像、拍照，以GAPDH 為內參條帶，采用Image J 圖像分析軟件分析條帶灰度，分別計算各組SCC25 細胞中KLF4 蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 miR-7-5p 在OSCC 細胞中表達下調

qRTPCR 結果顯示，miR-7-5p 在人正常口腔黏膜成纖維細胞hOMF 及3 種不同OSCC 細胞中的表達量比較，

F

=319.810，

P

＜0.001。 與hOMF（1.00±0.09）比較，miR-7-5p 在3 種不同OSCC 細胞SCC25（0.21±0.02）、Cal127（0.43±0.04）和Tca8113（0.48±0.05）中的表達量有不同程度的下調（

P

＜0.05）。在3 種不同OSCC細胞中，SCC25細胞miR-7-5p的基礎表達量最低，因此選擇SCC25細胞株進行后續實驗。

2.2 miR-7-5p mimics 轉染效果檢測

qRT-PCR 檢測結果顯示，Control 組、NC 組及miR-7-5p 組SCC25細胞中miR-7-5p 的表達量比較，

F

=547.999，

P

＜0.001。miR-7-5p 組（5.96±0.62）明顯高于Control 組（1.00±0.11）和NC 組（0.97±0.10）（

P

＜0.05），而Control 組和NC 組相比較差異無統計學意義（

P

＞0.05）。提示過表達miR-7-5p的SCC25細胞株構建成功。

2.3 過表達miR-7-5p 抑制SCC25 細胞增殖

MTT法檢測結果顯示，miR-7-5p 組SCC25 細胞吸光度在48 h和72 h時低于Control組和NC組（

P

＜0.05），Control 組和NC 組SCC25 細胞在24、48、72 h 時吸光度均差異無統計學意義（

P

＞0.05）。表明miR-7-5p 過表達能夠抑制SCC25細胞增殖。見表1。

表1 過表達miR-7-5p對口腔鱗狀細胞癌SCC25細胞24、48、72 h時增殖吸光度的影響/±s

2.4 過表達miR-7-5p 促進SCC25細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，Control 組、NC 組及miR-7-5p組SCC25 細胞凋亡率比較，

F

=23.168，

P

＜0.001。miR-7-5p 組SCC25 細胞凋亡率（24.41±8.15）%明顯高于Control 組（9.48±2.65）% 和NC 組（10.21±3.02）%（

P

＜0.05），而Control 組和NC 組SCC25 細胞凋亡率相比較差異無統計學意義（

P

＞0.05）。說明miR-7-5p過表達能夠誘導SCC25細胞發生凋亡。

2.5 miR-7-5p 靶向調控KLF4 基因

TargetScan 等生物信息學軟件預測結果顯示（圖1A），miR-7-5p與KLF43′-UTR存在互補配對堿基，提示KLF4可能是miR-7-5p 的直接靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗分析結果表明，與NC 組（1.00±0.10）比較，KLF4-Mut載體質粒miR-7-5p mimics 轉染后SCC25細胞相對熒光活性（1.00±0.11）差異無統計學意義（

t

=0.117，

P

=0.913），而KLF4-Wt 載體質粒miR-7-5p mimics 轉染后SCC25 細胞相對熒光活性（0.26±0.03）降低（

t

=16.830，

P

＜0.001），提示miR-7-5p 能夠靶向結合野生型KLF43′-UTR 序列。qRT-PCR 結果顯示，miR-7-5p 組SCC25 細胞中KLF4 mRNA（0.33±0.03）低于NC 組（1.00±0.10）（

t

=11.115，

P

＜0.001），蛋白質印跡法檢測結果（圖1B）也顯示其蛋白表達水平（0.42±0.04）低于NC 組（0.12±0.01）（

t

=12.603，

P

＜0.001）。 提示miR-7-5p 能夠負向調控KLF4的表達。

圖1 miR-7-5p靶向調節鋅指蛋白核轉錄因子4（KLF4）：A為miR-7-5p和KLF43′非翻譯區（3′-UTR）靶向結合示意圖；B為蛋白質印跡法檢測NC組與miR-7-5p組口腔鱗狀細胞癌SCC25細胞中KLF4蛋白表達水平

3 討論

多項研究表明miRNA 在多種癌癥的生物學特征中具有十分重要的作用，如細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。miRNA 在多種癌癥中的關鍵作用支持其作為治療靶標的潛在用途。近年來已經報道了多種miRNA參與OSCC的發生和發展，可作為OSCC診斷和治療的分子標志物。miR-7-5p 屬于miR-7 家族，其在多種癌癥類型中表達下調，表明其在腫瘤發生和腫瘤進展中的起重要作用。據報道，miR-7-5p 在胃癌中下調并與腫瘤淋巴結轉移和遠處轉移相關，miR-7-5p 通過調控PTEN/PI3K/AKT 信號轉導通路抑制胃癌細胞侵襲和遷移。Zhu 等報道，miR-7-5p 在胰腺導管腺癌組織和細胞系中的表達顯著下降，細胞功能測定表明，miR-7-5p 通過靶向SOX18 抑制PANC-1 細胞的增殖，遷移和侵襲。miR-7-5p 在腫瘤中表現出低表達，并且是關鍵的負調節因子。之前的研究顯示，與鄰近的正常組織相比，miR-7-5p 在OSCC 組織中表達下調。鑒于此，我們推測miR-7-5p 在OSCC 中也可能起到腫瘤抑制作用。然而，目前未見關于OSCC 中miR-7-5p 的表達或功能的研究。本研究初步證實了miR-7-5p 作為腫瘤抑制劑起作用，抑制OSCC 的發展。在本實驗中，miR-7-5p 在OSCC 細胞系中的表達明顯低于人正常口腔黏膜成纖維細胞。研究表明，miR-7-5p的過表達能夠抑制OSCC 細胞增殖，誘導細胞凋亡。此外，miR-7-5p 通過直接靶向其mRNA 的3'-UTR 而負調節KLF4表達。

KLF4作為關鍵的轉錄因子，其參與調節細胞增殖、分化、遷移和凋亡，并參與正常組織穩態的發展和維持。越來越多的證據表明，KLF4在癌癥進展和發展中起著抑癌或致癌基因的關鍵作用。目前研究顯示，KLF4 在OSCC 中呈高表達，扮演致癌基因的角色。最近報道指出，miR-7-5p 介導肝細胞生長因子的活性以抑制包括KLF4 致癌基因，其抑制正常細胞（至少乳腺上皮細胞MCF-10A）發展成癌細胞。Huang 等研究發現，KLF4 可作為miR-7的靶標參與環狀RNA ciRS-7調節的食管鱗狀細胞癌的遷移和侵襲。microRNA-轉錄因子自我調節反饋環是基因表達的穩態調節的關鍵機制，反饋環的失調與腫瘤發生和進展緊密相關。Wei等研究發現，KLF4-miR-7 自身調節反饋環的不平衡通過削弱microRNA 加工促進前列腺癌細胞生長。以上研究表明，miR-7 可能通過調節KLF4 的表達在腫瘤中發揮作用。為了更好地理解miR-7-5p 的腫瘤抑制作用，本實驗使用生物信息學軟件分析并鑒定KLF4作為miR-7-5p 的靶基因。使用雙熒光素酶報告基因實驗測定，進一步證實KLF4 是miR-7-5p 的直接靶標。miR-7-5p 過表達伴隨著OSCC 細胞中KLF4的表達下調。提示miR-7-5p 抑制SCC25 細胞增殖，誘導細胞凋亡可能與靶向調節KLF4的表達有關。

總之，miR-7-5p 在OSCC 細胞系中表達下調，并通過抑制KLF4 起到腫瘤生長抑制劑的作用。新發現的miR-7-5p/KLF4 軸提供了對OSCC 發生機制的深入了解，并為OSCC 提供了潛在的治療靶點。本實驗只在SCC25 細胞中探究miR-7-5p 靶向KLF4 基因對SCC25 細胞增殖和凋亡的影響尚顯不足，后續實驗將在不同細胞系及動物模型中進行證實。