微小RNA-425-5p靶向調控PTEN表達促進宮頸癌海拉細胞增殖、侵襲和遷移的實驗研究

高慧，王麗，王景華

宮頸癌是全球婦女中常見的第四大惡性腫瘤，給女性的身體健康和生活質量造成很大的威脅。認識和了解宮頸癌發生發展的分子機制是實現全面消除宮頸癌的第一步。既往研究顯示，在宮頸癌中存在著異常表達的微小RNA（miRNAs/miR），而這些miRNAs 是宮頸癌病理進展過程的重要調節因子。研究發現，miR-425-5p在宮頸癌病人組織和血清中高表達，與病人臨床分期、淋巴結轉移等緊密聯系，但miR-425-5p 在宮頸癌中的詳細功能與機制仍未完全闡明。本研究于2018年10月至2019年10月考察miR-425-5p 在宮頸癌海拉細胞增殖、侵襲和遷移中的作用，并探討其潛在的分子機制，以期為宮頸癌發病機制的深入研究提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 海拉細胞培養

海拉細胞（美國ATCC）采用含10% 胎牛血清（美國Gibco BRL 公司）的達爾伯克改良伊格爾培養基（DMEM 培養基）（美國Hyclone 公司）在常規條件為5% 二氧化碳、37 ℃的恒溫培養箱（美國Thermo公司）中培養。

1.2 海拉細胞轉染

在6 孔板中接種5×10個對數生長期的海拉細胞，常規培養至70%～80% 融合度時，參照轉染試劑Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）說明書步驟進行瞬時轉染。將轉染miR-425-5p 模擬物（mimics）/抑制劑（inhibitor）（上海吉瑪制藥公司）的細胞作為miR-425-5p mimics/inhibitor 組，轉染miR-425-5p mimics/inhibitor 陰性對照（上海吉瑪制藥公司）的細胞作為mimics/inhibitor-NC 組；轉染pcDNA3.1-PTEN 過表達載體質粒（上海欽誠生物公司）的細胞作為pcDNA3.1-PTEN 組，轉染pcDNA3.1 空載體質粒（上海欽誠生物公司）的細胞作為pcDNA3.1 組；轉染PTEN 干擾序列siRNAPTEN（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）的細胞作為siRNA-PTEN 組，轉染siRNA-PTEN 陰性對照（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）的細胞作為siRNANC 組。轉染5 h 后，更換新鮮DMEM 培養基并維持48 h。

1.3 實時熒光定量PCR檢測海拉細胞中miR-425-5p表達

收集轉染48 h后的miR-425-5p mimics/inhibitor組、mimics/inhibitor-NC組海拉細胞，加入1 mL Trizol試劑（上海碧云天生物公司）獲取總RNA，參照逆轉錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司）隨附步驟將RNA進行逆轉錄；以獲得的產物互補DNA（cDNA）作為模板，參照定量PCR試劑盒（美國Applied Biosystems公司）說明書[miR-425-5p 正向引物序列為5’-TGCGGAATGAC-ACGATCACTCCCG-3’，反向引物序列為5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6正向引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’（上海吉瑪制藥公司）］并按照設定的PCR擴增條件（95 ℃2 min 后，進入40個循環階段：95 ℃10 s、60 ℃20 s、72 ℃20 s；72 ℃5 min）上PCR 儀（德國Roche Diagnostics GmbH 公司）進行擴增。采用2法計算各組海拉細胞中miR-425-5p的相對于U6的表達水平。

1.4 MTT 法檢測海拉細胞增殖

將轉染后5×10個miR-425-5p mimics/inhibitor 組、mimics/inhibitor-NC 組海拉細胞接種至96 孔板，并設置空白調零組：無細胞培養基。常規培養48 h 后，每孔加入20 μL（濃度為5 g/L）噻唑藍（MTT）溶液（美國Sigma 公司）；孵育4 h 后，棄上清液并每孔加入200 μL DMSO（美國Sigma 公司）震蕩反應15 min。在酶標儀（美國Bio-Rad 公司）490 nm 波長處檢測各組海拉細胞吸光度，并計算出各組細胞存活率[細胞存活率=（實驗組吸光度－空白組吸光度）/（對照組吸光度－空白組吸光度）×100%］。實驗重復3 次。后續pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTEN 組、siRNA-NC 組和siRNA-PTEN組細胞增殖活力檢測方法同上。

1.5 平板克隆形成實驗檢測海拉細胞克隆形成能力

胰蛋白酶（美國Hyclone 公司）消化收集miR-425-5p mimics/inhibitor 組、mimics/inhibitor-NC 組細胞，在培養皿中分別接種50、100 和200個細胞，每組設置3個平行實驗。輕輕搖動使其分散均勻后，常規培養14～21 d。期間觀察到培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。以4% 多聚甲醛固定20 min，0.1% 結晶紫染色15 min。沖洗并干燥后，在顯微鏡（日本Olympas公司）中觀察并計數大于15個細胞的克隆數，并根據克隆數/接種細胞數×100% 計算出克隆形成率（%）。后續pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTEN 組、siRNA-NC 組和siRNA-PTEN 組細胞克隆形成率檢測方法同上。

1.6 Transwell 小室實驗檢測海拉細胞侵襲和遷移

（1）侵襲實驗：將無血清培養基和Matrigel 基質膠（美國BD 公司）按照6∶1 比例混勻后，取50 μL 平鋪至Transwell小室（美國Corning公司）上層中，置于細胞培養箱中孵育5 h 使基質膠充分凝固。收集miR-425-5p mimics/inhibitor 組、mimics/inhibitor-NC組細胞后，以無血清DMEM 將細胞濃度調整為10個/毫升。在Transwell 小室上室中添加200 μL 細胞懸液，并在下室中加入600 μL 含血清DMEM。常規孵育24 h 后，以4% 多聚甲醛和0.1% 結晶紫對濾膜下的細胞進行固定與染色。在顯微鏡下測量各組穿膜的海拉細胞數，結果取隨機選取的3個視野細胞數的平均值。（2）遷移實驗：除了不需要以Matrigel基質膠對Transwell 小室基底膜進行包被外，其余步驟與侵襲實驗相同。后續pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-PTEN 組、siRNA-NC 組和siRNA-PTEN 組細胞侵襲和遷移能力的檢測方法同上。

1.7 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測海拉細胞中磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達

以RIPA 裂解液（上海碧云天生物公司）獲取待測海拉細胞總蛋白。將100 ℃變性后的蛋白樣品上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（北京索萊寶生物公司）中行電泳分離后，轉至聚偏二氟乙烯膜。以5% 脫脂奶粉封閉2 h后，加入PTEN 一抗（1∶1000，美國Abcam 公司）4 ℃下孵育24 h。再以辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2000）室溫孵育2 h 后，暗室中滴加ECL（上海碧云天生物公司）顯影曝光。在凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad 公司）中掃描并分析海拉細胞中PTEN 蛋白相對于內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達水平。實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-425-5p 和PTEN 的表達

將PTEN-3’非翻譯區（UTR）片段克隆重組至熒光素酶載體上來構建PTEN 野生型（WT）載體質粒，記為PTEN-WT 質粒；另外，將miR-425-5p與PTEN-3’UTR 結合位點定點突變后克隆重組至熒光素酶載體上來構建PTEN 突變型（MUT）載體質粒，記為PTEN-MUT 質粒。在24 孔細胞板接種將10個對數生長期的海拉細胞，常規培養至80%融合度時，參照Lipofectamine2000 說明書，將PTEN-WT、PTEN-MUT 質粒分別與miR-425-5p mimics/inhibitor 及其陰性對照共轉染至海拉細胞中，其中每組設置3個復孔。轉染48 h后依照熒光素酶活性檢測試劑盒（美國Promega 公司）隨附指南測量細胞的熒光素酶活性。

2 結果

2.1 轉染后各組海拉細胞中miR-425-5p 的表達水平

實時熒光定量PCR 檢測結果表示，mimics-NC組（1.00±0.05）、miR-425-5p mimics 組（4.88±1.23）、inhibitor-NC 組（1.00±0.06）、miR-425-5p inhibitor 組（0.26±0.02）海拉細胞中miR-425-5p 的表達水平比較差異有統計學意義（

F

=34.585，

P

＜0.001）。 與mimics-NC 組比較，miR-425-5p mimics 組明顯升高（

P

＜0.05）；與inhibitor-NC組比較，miR-425-5p inhibitor組明顯降低（

P

＜0.05）。

2.2 miR-425-5p 對宮頸癌海拉細胞增殖的影響

MTT 法和平板克隆形成實驗檢測結果顯示，轉染miR-425-5p mimics 后海拉細胞存活率和克隆形成率均比mimics-NC 組明顯升高（

P

＜0.05）；但轉染miR-425-5p inhibitor 后海拉細胞存活率和克隆形成率均明顯低于inhibitor-NC 組（

P

＜0.05）。 見表1、圖1。

表1 各組細胞存活率和克隆形成率的比較/（%，±s）

圖1 各組宮頸癌海拉細胞克隆形成圖片 圖2 轉染miR-425-5p模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitor）的宮頸癌海拉細胞遷移和侵襲細胞（結晶紫染色×200） 圖5 磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）表達對宮頸癌海拉細胞增殖、侵襲和遷移的影響：5A為各組宮頸癌海拉細胞克隆形成圖片；5B為各組宮頸癌海拉細胞遷移和侵襲細胞（結晶紫染色×200）

2.3 miR-425-5p 對宮頸癌海拉細胞侵襲和遷移的影響

Transwell 小室實驗檢測結果表示，miR-425-5p mimics 組中侵襲和遷移細胞數均明顯高于mimics-NC 組，而miR-425-5p inhibitor 組中侵襲和遷移細胞數均比inhibitor-NC 組明顯減少（

P

＜0.05）。見表2、圖2。

表2 轉染miR-425-5p模擬物（mimics）/抑制劑（inhibitor）的細胞侵襲和遷移細胞數的比較/（個，±s）

2.4 miR-425-5p 靶基因預測及其驗證

生物信息學軟件TargetScan（http：//www.targetscan.org）預測結果見圖3A，miR-425-5p可靶向結合PTEN 3’UTR；雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果見表3，相比于轉染mimics-NC，miR-425-5p mimics 可使PTEN-WT 的熒光素酶活性明顯降低（

P

＜0.05）；相較于轉染inhibitor-NC，miR-425-5p inhibitor 可使PTEN-WT 的熒光素酶活性明顯升高（

P

＜0.05）。同時，蛋白質印跡法檢測結果圖3B、表3 所示，與各自陰性對照組比較，miR-425-5p mimics 可使海拉細胞中PTEN 蛋白表達水平明顯降低，而miR-425-5p 可使海拉細胞中PTEN蛋白表達水平明顯升高（

P

＜0.05）。

圖3 miR-425-5p 和PTEN 靶向關系的驗證：A 為miR-425-5p 與PTEN 3’非翻譯區（UTR）存在互補的結合位點，B為蛋白質印跡法檢測磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達電泳圖

表3 各組細胞熒光素酶活性和磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達水平的比較/±s

2.5 PTEN 表達對宮頸癌海拉細胞增殖、侵襲和遷移的影響

將pcDNA3.1-PTEN 過表達質粒和靶向PTEN 的小RNA 干擾序列siRNA-PTEN 轉染至海拉細胞后，進一步觀察PTEN 表達對宮頸癌海拉細胞增殖和侵襲的影響，結果見圖4、圖5、表4。pcDNA3.1-PTEN 組細胞中PTEN 蛋白表達水平比pcDNA3.1 組高，而細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數均比pcDNA3.1 組低（

P

＜0.05）；siRNA-PTEN組細胞中PTEN蛋白表達水平低于siRNANC組，而細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數均高于siRNA-NC組（

P

＜0.05）。

表4 各組中磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達水平、細胞存活率、克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數的比較/±s

圖4 蛋白質印跡法檢測各組細胞中磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）蛋白表達電泳圖

3 討論

3.1 miR-425-5p促進宮頸癌海拉細胞的增殖、侵襲和遷移

miRNAs 是一類內源性非編碼RNA，雖然只占人類基因的1%，但其已被證明與腫瘤發生發展密切相關。miR-425-5p 是miRNAs 家族中的重要成員，在肝癌、胰腺癌、結直腸癌等腫瘤中的水平異常升高，且可通過對腫瘤細胞增殖、轉移等過程的調節起促癌作用。例如：Quan 等在腎癌中發揮miR-425-5p 表達水平明顯上調，且具有促進癌細胞增殖、侵襲、遷移和抑制細胞凋亡的作用，被認為可能是腎癌發生發展過程中重要的致癌基因。Zhang 等研究發現，miR-425-5p 高表達是導致前列腺癌惡性發展的重要機制，其作為促癌因子加速前列腺細胞增殖和轉移等過程。Wu 等報道，miR-425-5p 在肝癌的惡性進展過程中發揮著積極作用，其可通過靶向調控FOXD3表達促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲并阻止細胞凋亡。

miR-425-5p 在宮頸癌中存在著異常高表達，且其表達水平與病人不良預后密切相關；然而，miR-425-5p 在宮頸癌發生發展中的作用機制并不完全清楚。本研究通過轉染miR-425-5p inhibitor 成功下調miR-425-5p 表達后，MTT 法檢測發現宮頸癌海拉細胞增殖活力明顯降低。該結論與Zhang 等通過MTT 法所得出的miR-425-5p 低表達可抑制宮頸癌海拉細胞增殖的結論相符。此外，本研究通過平板克隆形成實驗進一步證實了下調miR-425-5p 表達具有抑制宮頸癌海拉細胞增殖的作用，上調miR-425-5p 表達可增強宮頸癌海拉細胞增殖能力。另外，本研究通過Transwell 小室實驗還檢測到，miR-425-5p 高表達可促進宮頸癌海拉細胞侵襲和遷移，而miR-425-5p 低表達可抑制宮頸癌海拉細胞侵襲和遷移。以上數據表明，miR-425-5 作為宮頸癌的促癌因子，通過影響宮頸癌的細胞增殖、侵襲和遷移加速宮頸癌的發生發展。

3.2 靶向PTEN 是miR-425-5p 調節宮頸癌海拉細胞增殖、侵襲和遷移的重要機制

PTEN 是一個定位于10q23 染色體上的抑癌基因，可通過脂質磷酸酶活性、蛋白磷酸酶活性和調控細胞內相關信號通路等影響細胞增殖、分化和遷移等過程，并參與宮頸癌等腫瘤的發生發展。Peng 等研究指出，PTEN 在宮頸癌中呈現低表達，且可被miR-301a 靶向調控影響宮頸癌細胞增殖。另外，Zhu 等研究指出，PTEN 是miR-641 下游靶基因，在miR-641 介導的宮頸癌細胞侵襲和遷移過程中發揮著重要的抑制作用。Xiao等在乳腺癌研究中發現miR-425-5p可通過靶向調控PTEN 表達促進癌細胞增殖和遷移。本研究證實，PTEN 是miR-425-5p 的靶基因。本研究轉染pcDNA3.1-PTEN 過表達質粒成功上調PTEN 表達后發現，宮頸癌海拉細胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力明顯減弱；轉染PTEN-siRNA 成功下調PTEN 表達后發現，宮頸癌海拉細胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力明顯增強。結果表明，PTEN 對宮頸癌海拉細胞的增殖、侵襲和遷移具有腫瘤抑制作用。

總之，本研究提供了新的證據，表明miR-425-5p 促進宮頸癌惡性進展的作用機制是通過靶向調控PTEN表達來實現的。這種新發現的miR-425-5p/PTEN 調控網絡表明其有潛力成為未來宮頸癌病人的預后標志物和有效靶點。

（本文圖1，2，5見插圖12-4）