血清微小RNA-181c、微小RNA-146a對急性腦梗死病人神經功能缺損及預后的影響

李漢穎，李漢宇，李增祥

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是神經系統多發病與常見病，致殘率、病死率較高，帶來的社會及經濟負擔已成為全球性問題，因此加強其研究意義重大。微小RNA（microRNA，miR）是高度保守的短小RNA，能通過對靶miR 的降解、翻譯、抑制介導轉錄后基因沉默，參與蛋白表達的調節，在神經系統疾病的發生、進展等過程中扮演重要角色。miR-181c、miR-146a 是miR 的兩個亞型，與首發精神分裂癥病人認知功能損傷、腦卒中后小膠質細胞/巨噬細胞極化密切相關。但對ACI 病人神經功能缺損及預后的影響尚不明確，本研究對此進行探討，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取南陽市中醫院2018年1月至2019年7月ACI 病人135 例作為研究對象。納入標準：均符合ACI 診斷標準；首次發病；發病前無認知功能異常、精神障礙、肢體功能障礙。排除標準：合并惡性腫瘤者；老年癡呆者；感染類疾病者；血液系統疾病者；繼發癲癇者；存在聽力障礙者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病人均對本研究知情，自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1

神經功能評估 入院時采用美國國立衛生院神經功能缺損評分（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評估病人神經功能，滿分42分，分值越高，神經缺損越嚴重。

1.2.2

標本采集與檢測 入院時、入院第3 天分別采集病人肘部靜脈血5 mL，3500 r/min 離心15 min，取上清。加入細胞裂解液，總RNA 提取試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司）提取總RNA，紫外分光光度法檢測提取總RNA 濃度與質量，采用逆轉錄試劑盒（南京億迅生物科技有限公司）逆轉錄為互補DNA（cDNA），miR-181c 正向、反向引物分別為5’-AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU-3’、5’-UCACCGACAGGUUGAAUGUUUU-3’，miR-146a 正向、反向引物分別為5’-GTTTACCTACTCGTCTCTGGTAC-3’、5’-CCTTATCCCAATACGTGTCGACATCAT-3’，反應體系包括引物、dNTP（百奧邁科生物技術有限公司）、Taq DNA 聚合酶（北京藍博斯特生物技術有限公司）、靶序列DNA和PCR反應緩沖液（南京億迅生物科技有限公司）共20 μL，PCR 反應條件為95 ℃5 min 預變性，95 ℃40 s 變性，60 ℃20 s 退火，72 ℃15 s延伸，以2表示目的基因表達量。

1.3 觀察指標

（1）對比不同神經功能病人臨床資料。（2）比較不同NIHSS 評分病人血清miR-181c、miR-146a 水平。（3）分析血清miR-181c、miR-146a 與NIHSS評分相關性。（4）比較不同預后病人血清miR-181c、miR-146a 水平。（5）分析血清miR-181c、miR-146a 與預后的相關性。（6）分析血清miR-181c、miR-146a 預測預后的截斷值、靈敏度、特異度。（7）比較血清miR-181c、miR-146a高危、低危病人生存曲線。

2 結果

2.1 一般資料

兩組年齡、發病至入院時間、體質量指數等一般資料均衡可比（

P

＞0.05），見表1。

表1 不同美國國立衛生院神經功能缺損評分（NIHSS）急性腦梗死病人臨床資料對比

2.2 不同NIHSS 評分病人血清miR-181c、miR-146a水平

NIHSS評分≥16分病人血清miR-181c水平高于5～15分、＜5分病人，miR-146a 水平低于5～15分、＜5分病人（

P

＜0.05），見表2。

表2 不同美國國立衛生院神經功能缺損評分（NIHSS）急性腦梗死病人血清miR-181c、miR-146a水平比較/±s

2.3 血清miR-181c、miR-146a 與NIHSS 評分相關性

Pearson相關性分析，血清miR-181c與NIHSS評分呈正相關（

r

=0.704，

P

＜0.001），miR-146a 與NIHSS評分呈負相關（

r

=-0.695，

P

＜0.001）。

2.4 不同預后病人血清miR-181c、miR-146a 水平

根據30 d 預后分為生存者、死亡者。生存者入院時、入院第3 天血清miR-181c 水平低于死亡者，miR-146a水平高于死亡者（

P

＜0.05），見表3。

表3 不同預后急性腦梗死病人血清miR-181c、miR-146a水平比較/±s

2.5 血清miR-181c、miR-146a 與預后的關系

以ACI病人預后作為因變量（生存=0，死亡=1），采用向后剔除法篩選變量，

α

=0.10，血清miR-181c、miR-146a 作為自變量（以所有病人平均值為界：≤平均值=1，＞平均值=2；血清miR-181c 平均值為1.50，miR-146a 平均值為0.70），logistic 回歸分析顯示，血清miR-181c、miR-146a 與預后顯著相關（

P

＜0.05），見表4。

表4 血清miR-181c、miR-146a與135例急性腦梗死預后的關系

2.6 血清miR-181c、miR-146a 對預后預測價值

ROC 曲線分析顯示，入院時第3 天miR-146a 預測預后的AUC 最大，為0.803，當截斷值≤0.69 時，靈敏度為91.67%，特異度為68.18%。見表5。

表5 血清miR-181c、miR-146a對135例急性腦梗死預后預測價值的ROC分析結果

2.7 生存分析

以入院第3 天ROC 曲線最佳截斷值為分界，分為miR-181c 高危（＞1.42）與低危（≤1.42）、miR-146a 高危（≤0.69）與低危（＞0.69）。miR-181c高危與低危（

χ

=16.201）、miR-146a高危與低危（

χ

=12.823）生存曲線比較，差異有統計學意義（均

P

＜0.001）。

3 討論

3.1 研究的意義

目前ACI 的治療手段主要包括抗凝、溶栓、神經營養等，雖能在一定程度上改善預后，但仍存在較大比例病人發生明顯的神經功能缺損，導致功能障礙，并影響病人預后，因此研究與神經功能缺損相關的分子機制至關重要。

3.2 血清miR-181c 對ACI 病人神經功能缺損及預后的影響

miR-181c 來源于核內基因組，可移位至線粒體，并影響其基因組編碼蛋白質的合成。Ma等報道顯示，卒中病人的血miR-181c 水平與健康個體相比，差異有統計學意義。Zhang 等采用小核仁RNA 宿主基因6 靶向miR-181c，發現神經元凋亡情況與空白對照呈現出顯著差異，提示miR-181c可調控神經元的凋亡。本研究發現，NIHSS評分≥16分病人血清miR-181c 水平高于5～15分、＜5分病人，且死亡病人入院時、入院第3 天miR-181c 高于生存者，提示神經功能缺損嚴重病人和死亡病人，血清miR-181c 水平較高，并與NIHSS 評分呈正相關，與預后顯著相關，表明miR-181c 可影響病人神經功能與預后，可能為評估ACI 后神經功能與預后提供了一個思路。王志等發現，預后不良腦梗死病人入院時血清miR-181c 水平高于預后良好者，與病人預后密切相關，本研究結論與之相似。miR-181c 可介導腦缺血后腫瘤壞死因子-α 等炎性因子的釋放，直接損傷神經元，并能通過轉移至線粒體，調節相關蛋白的表達，引起線粒體復合物Ⅳ的重構與線粒體功能紊亂，減弱線粒體呼吸作用，加重缺血損傷與神經功能缺損程度，故可影響病人預后。同時本研究還發現，miR-181c 高危與低危病人生存曲線存在顯著差異，直接佐證了miR-181c 表達水平可影響病人預后。且入院第3 天miR-181c 預測預后的AUC大于入院時，為0.779，呈現出較高的價值，可為臨床預測預后提供量化參考。

3.3 血清miR-146a 對ACI 病人神經功能缺損及預后的影響

miR-146a 與細胞侵襲、轉移、免疫、炎癥和細胞凋亡高度相關。Zhou 等研究表明，腦缺血再灌注損傷后，miR-146a 表達下調，而采用miR-146a 模擬物上調miR-146a 的表達，有效降低了Caspase7 水平，減少了神經細胞的凋亡，呈現出神經保護作用。本研究發現，NIHSS 評分≥16分病人血清miR-146a 水平，低于5～15分、＜5分病人，且死亡病人入院時、入院第3 天miR-146a 低于生存者，提示神經功能缺損嚴重病人和死亡病人，血清miR-146a水平較低，并與NIHSS 評分呈負相關，與預后顯著相關，表明檢測血清miR-146a 表達可評估病人神經功能與預后，上調miR-146a 表達可能為ACI 病人神經功能、預后的改善提供了一個潛在靶點。劉明等報道顯示，腦梗死病人血清miR-146a 表達與腦梗死病人NIHSS 評分呈負相關，支持本研究結論。關于miR-146a 改善神經缺損與預后的機制可能有：（1）miR-146a 的上調，能通過負調節Janus 相關激酶2/轉錄激活因子3 信號通港路，抑制神經細胞凋亡，改善炎癥反應，從而發揮抗缺血性損傷的神經保護作用；（2）miR-146a 能通過調控內皮細胞，抑制血管收縮，舒張血管，改善腦缺血狀態；（3）miR-146a高表達可抑制中性粒細胞、內皮細胞、趨化因子等，改善血液黏稠性，抑制血栓形成，有利于ACI后缺血灶血流的恢復。同時本研究顯示，以ROC分析最佳截斷值為分界，miR-146a 高危與低危者生存曲線比較差異顯著，再次證實miR-146a 對病人預后的影響。ROC分析顯示，入院時第3 天miR-146a 預測預后的AUC 最大，為0.803，當截斷值≤0.69 時，靈敏度為91.67%，特異度為68.18%，可為臨床選取合適指標預測預后提供參考。本研究不足之處在于，病例數較少，仍需后續擴大樣本量進行驗證。

血清miR-181c、miR-146a 與ACI 病人神經功能缺損及預后顯著相關，均具有較高的預后預測價值，可能為ACI病人神經功能、預后的改善提供了一個潛在靶點。