一株棲稻假單胞菌NYCS1-5的鑒定及其對玉米的耐鹽促生功能

馮健茹,俄文慧*,朱秀玲,周春燕,馬仕萌, 李明鵬,丁延芹,杜秉海,汪城墻**

一株棲稻假單胞菌NYCS1-5的鑒定及其對玉米的耐鹽促生功能

馮健茹1,俄文慧1*,朱秀玲1,周春燕2,馬仕萌1, 李明鵬3,丁延芹1,杜秉海1,汪城墻1**

1. 山東農業大學生命科學學院/山東省鹽堿地植物-微生物聯合修復工程技術研究中心/山東省農業微生物重點實驗室, 山東 泰安 271018 2. 山東農業大學動物科技學院/動物醫學院, 山東 泰安 271018 3. 山東金銘生物技術有限公司, 山東 鄒平 256200

本試驗針對實驗室前期保藏的菌株NYCS1-5進行了細胞和菌落形態鑒定、生理生化分析、耐鹽促生功能研究、16S rDNA系統發育樹分析，鑒定此菌株為棲稻假單胞菌（）。經研究，棲稻假單胞菌NYCS1-5同時具備較強的解磷和溶磷能力，也具有一定的解鉀能力和產IAA的功能，該菌耐鹽范圍可達7%。通過玉米營養液培養實驗也研究了菌株NYCS1-5對玉米在有鹽（100 mmol/L NaCl）、無鹽條件下的促生功能，記錄玉米在生長第4、10和12 d的株高和根長生長狀況。在有鹽條件下，玉米生長10 d時，菌株NYCS1-5處理組的玉米生理株高和根長分別提高了21.36%和16.64%，均達到顯著性差異，菌株NYCS1-5表現出對玉米的耐鹽促生功能。在無鹽條件下，菌株NYCS1-5對玉米生理株高及根長也表現出了一定的促進作用；玉米生長12 d時，菌株NYCS1-5處理組的玉米生理株高增加了17.38%，達到顯著差異。因此，此棲稻假單胞菌NYCS1-5對玉米等作物有耐鹽促生應用價值。

棲稻假單胞菌; 菌種鑒定; 玉米; 耐鹽促生

玉米是耕種面積廣、食用價值高的農作物之一，是我國不可缺少的一種糧食作物，也是牛、豬等動物的重要飼料，對農業發展起著至關重要的作用[1]。人們普遍認為玉米對環境條件要求較低，可以在大多數耕地上種植，然而實際玉米耐鹽堿能力弱，是一種具有代表性的非鹽生植物[2]，在鹽堿地脅迫下，玉米生長緩慢并且生育期推遲[3]。合理改良鹽堿地對玉米各項生理指標含量的增加及玉米增產有著重要作用。同時，如何修復并且有效利用鹽堿地資源也是我國一直以來的研究熱點問題[4]。

生物修復是利用生物的生命代謝活動減少有害物質濃度的一種技術，其成本較低、成效較為顯著并且對環境影響較小[5]。其中，微生物菌肥具有卓越的土壤改良、植物促生和綠色安全的環境親和力，因此施加微生物菌肥成為應對鹽堿地問題備受青睞的有效手段[6]。微生物資源宏大，但用于生產微生物肥料的菌種資源卻仍有限[7]。植物根際促生菌[8,9]（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指在植物根系的土壤中存在并且進行繁殖的有益菌群，可通過多種作用機制來促進植物的生長，如產植物激素、生物固氮、促進植物與其它有益微生物共生等等[10,11]。將植物根際促生菌接種于植物根際可以有效促進植物生長，提高植物對干旱、鹽堿等逆境脅迫的抵抗能力[12,13]。

假單胞菌屬()是植物根際防治及促生的優選菌種之一[14]，典型代表有銅綠假單胞菌()、惡臭假單胞菌()[15]、熒光假單胞菌（）[16]和施氏假單胞菌（）[17]等。假單胞菌屬的菌株對多種作物具有生防作用，例如，Pham VT等[18]溫室實驗證明還具有固氮促生功能，A1501可以和水稻根部結合促進水稻的生長[19]；KT2440可以改善鹽脅迫下土壤中大豆和玉米植物的生長。棲稻假單胞菌（）中的有些菌株曾被證實具有PGPR功能促進一些植物的生長[20]，例如，菌株PGP01對梨屬體外生根和植株生長具有有益影響，可作為IBA的替代品應用于體外組織培養[21]。截至目前，在國內的研究更少[22]，的確切促生功能尚未完全解析，對玉米的耐鹽促生研究尚未開展。本實驗室前期保藏了一株菌NYCS1-5，鑒定為，具有PGPR的典型功能特征，將菌株NYCS1-5與玉米植株結合，發現在有無鹽條件下對玉米有明顯促生功能。此菌為新型微生物菌劑的研發提供有效的菌種資源，助力緩解土壤鹽堿化問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株NYCS1-5由本實驗室保藏

1.1.2 培養基與試劑LB培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂15-～20 g，定容至1000 mL，調節pH為7.0。121 ℃滅菌20 min。

有機磷細菌培養基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，酵母浸粉0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，卵磷脂0.2 g，磷酸鈣1 g，瓊脂15 g，定容至1000 mL。121 ℃滅菌20 min。

無機磷細菌培養基：蔗糖5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸鈣0.1 g，磷酸氫二鈉20 g，氯化鐵0.005 g，定容至1000 mL。

硅酸鹽細菌培養基：蔗糖5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸鈣0.1 g，磷酸二氫鈉2.0 g，氯化鐵0.005 g，玻璃粉1 g，瓊脂15 g，定容至1000 mL。

R2A培養基：干酪素10 g，酵母粉0.5 g，葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，硫酸鎂0.05 g，丙酮酸鈉0.3 g，L-色氨酸0.2 g，定容至1000 mL。

淀粉培養基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，定容至1000 mL。

甲基紅實驗培養基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 5 g，氯化鈉 5 g，定容至 1000 mL;

霍格蘭工作液：50×大量元素母液A、大量元素母液B、鐵鹽溶液、微量元素溶液；（注：大量元素母液A：四水合硝酸鈣945 mg/L、硝酸鉀506 mg/L、硝酸銨80 mg/L；大量元素母液B：硫酸鎂493 mg/L、磷酸二氫鉀136 mg/L；鐵鹽溶液：七水合硫酸亞鐵2.78 g、乙二胺四乙酸二鈉2.73 g、蒸餾水500 mL，兩種試劑分別溶解混合；微量元素溶液：碘化鉀0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、硫酸錳22.3 mg/L、硫酸鋅8.6 mg/L、鉬酸鈉0.25 mg/L、硫酸銅0.025 mg/L、氯化鈷0.025 mg/L）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化與形態特征觀察將保藏在甘油管的菌株NYCS1-5采用梯度稀釋、三區劃線[23]的方法進行分離純化。選擇長勢優良的單菌落在LB培養基上三區劃線，置37 ℃恒溫培養箱培養12～24 h。長出單菌落后，觀察其大小、質地光澤度、粘稠度、顏色、透明度、形態、邊緣結構、凸起程度[24]等特性。采用革蘭氏染色[25]方法對菌株進行染色，并在顯微鏡下觀察菌體細胞顏色及形態大小。

1.2.2 菌株的生理生化特性及促生功能鑒定（1）菌株常規生理生化特性鑒定采用海博生物公司的細菌微量生化鑒定管進行。

（2）解鉀能力鑒定用牙簽挑取單菌落于硅酸鹽細菌培養基平板上，將解鉀培養基于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養1～2 d，觀察培養基中是否有油滴狀菌落出現。出現油滴狀為陽性，具有解鉀能力；不出現油滴狀為陰性，無解鉀功能[26]。

（3）解磷能力鑒定用牙簽挑取單菌落于有機磷細菌培養基中，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，觀察平板中是否有解磷透明圈出現。出現透明圈呈陽性，表明具有解磷能力；不出現透明圈為陰性，不具解磷功能[27]。

（4）溶磷能力鑒定用牙簽挑取單菌落在無機磷細菌培養基中，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，觀察培養基中是否有透明圈出現。出現透明圈呈陽性，表明菌株具有溶磷能力；不出現透明圈為陰性，即不具溶磷功能[28]。

（5）水解淀粉能力的測定用牙簽挑取單菌落在淀粉水解培養基中，于37 ℃恒溫培養箱培養24 h。長出單菌落后，在單菌落周圍滴加碘液，觀察是否出現透明圈，出現透明圈呈陽性，能水解淀粉；不出現透明圈則為陰性，即不能水解淀粉[29]。

（6）甲基紅實驗從LB固體培養基取單菌落于甲基紅液體培養基中，置于37 ℃、180 rpm/min搖床培養24 h，滴加甲基紅試劑，觀察顏色變化。如果溶液變為黃色為陰性，溶液變為紅色為陽性。

（7）產IAA能力測定用牙簽取單菌落于含有L-色氨酸的R2A液體培養基中，置于28 ℃、180 rpm/min搖床培養4 d。在白色陶瓷板上滴加50 μL菌懸液，再加入50 μL的Salkowski比色液，同時用50 mg/L的IAA加入Salkowski比色液作為陽性對照。將白色陶瓷板在室溫黑暗中放置30 min，觀察顏色變化。若顏色變紅，表示該菌株具有產生IAA的功能[30]。

1.2.3 菌株NYCS1-5的16S rDNA測序菌株NYCS1-5的DNA用細菌基因組試劑盒[29]提取。利用引物 27F/1492R（正向引物序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物序列：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[31]進行16S rDNA序列擴增。將樣品送至青島睿博興科公司進行測序，得到測序結果在NCBI網站進行比對，并通過MEGA5構建進化樹。

1.2.4 菌株NYCS1-5抗鹽譜測定挑取菌株NYCS1-5單菌落接種在不同NaCl濃度梯度的固體LB平板上，NaCl質量分數分別為0%、1%、2%、4%、6%、7%、8%，進行三區劃線，培養72 h觀察菌落生長狀況。

1.2.5 玉米培養液實驗 本實驗共設置4個處理組：（1）CK組：空白對照，不加菌、不加鹽，即 0 mmol/L NaCl營養液；（2）CB組：加菌、不加鹽，即0 mmol/L NaCl營養液+菌株NYCS1-5菌懸液；（3）CS組：不加菌、加鹽，即100 mmol/L NaCl營養液；（4）CBS組：加菌、加鹽，即為100 mmol/L NaCl營養液+菌株NYCS1-5菌懸液。(注：加菌處理指的是玉米種子在菌液中沾菌NYCS1-5接種，菌液濃度106cfu/mL)

1.2.6 數據處理及統計方法數據統計和數據處理采用Excel2010和SPSS2020，圖形繪制采用Origin2010等軟件。

2 結果與分析

2.1 菌株NYCS1-5菌落和細胞形態特征

將菌株NYCS1-5劃線到LB固體培養基，觀察菌落的形態特征，如圖1A所示。菌株NYCS1-5菌落呈黃色，形成的菌落表面皺起、邊緣不整齊、不透明、粘稠度較低、易挑起。經革蘭氏染色，如圖1B所示，菌株NYCS1-5為革蘭氏陰性菌，細胞形態為桿狀。

圖1 菌株NYCS1-5的菌落和細胞形態（放大倍數10×100）

2.2 菌株NYCS1-5的生理生化特征及促生功能

使用細菌微量生化鑒定管鑒定菌株NYCS1-5的生理生化特征，結果如表1所示。其中，葡萄糖、阿拉伯糖、麥芽糖、半乳糖生化管為黃色，衛矛醇半固體發酵管呈黃色，賴氨酸脫羧酶肉湯、鳥氨酸脫羧酶肉湯為紫色，為陽性，表明可以利用或發生反應；乳糖發酵管呈紫色，ONPG呈白色，蔗糖發酵管呈綠色，D-纖維二糖、鼠李糖、山梨醇呈藍綠色，硫化氫生化管呈無色，色氨酸肉湯不變紅，MR-VP生化管呈黃色，棉子糖發酵管呈綠色，水楊苷生化管為紫色，為陰性，表明不可以利用或不發生反應。

對菌株NYCS1-5的部分促生功能進行鑒定。淀粉水解實驗中，淀粉培養基中不出現透明圈，呈陰性；甲基紅實驗中溶液呈現黃色，為陰性。測定解鉀能力時，培養基上有油滴狀菌落，為陽性；產生長素能力測定時出現紅色變化，表示該菌株具有產生IAA的功能，為陽性；測定解磷能力時，有機磷培養基中呈現透明圈，為陽性（見圖2A）。測定溶磷能力時，無機磷培養基出現透明圈，為陽性（見圖2B）。菌株NYCS1-5具有解鉀、解磷、溶磷和產生長素能力，有助于土壤養分活化及促進植物生長。

表1 棲稻假單胞菌NYCS1-5的生理生化特性及促生功能

注：表內“+”表示為陽性，“-”表示為陰性。Note: “+”represents positive；“-” represents negative.

圖2 菌株NYCS1-5解有機磷

（A）和溶無機磷Dissolved inorganic phosphorus（B）出現的透明圈 Transparent circle

2.3 菌株NYCS1-5的分子生物學鑒定

測定菌株NYCS1-5的16S rDNA序列并提交到NCBI數據庫進行比對。找出7株不同種類且相似度在98%以上模式菌株的16S rDNA序列構建系統發育樹。選取模式菌株：棲稻假單胞菌((NR_115005.1))、耐冷假單胞菌((NR_042191.1))、食油假單胞菌((NR_043423.1))、施氏假單胞菌((MT027239.1))、稻假單胞菌((NR_133023.1))。所得結果見圖3。由系統發育樹可知，所篩選菌株1-5與棲稻假單胞菌()最為接近。

圖3 依據16SrDNA序列構建的菌株NYCS1-5的系統發育樹

2.4 菌株NYCS1-5抗鹽譜測定

挑取菌株NYCS1-5單菌落于含有不同濃度梯度NaCl的LB培養基中，于37 ℃培養72 h。菌株NYCS1-5在含質量分數0%～7%的NaCl培養基中均能生長（如圖4），在含質量分數8% NaCl的培養基中不能生長。

圖4 菌株NYCS1-5在不同濃度NaCl培養基上的生長結果

注：A含0% NaCl濃度；B含1% NaCl濃度; C含2% NaCl濃度; D含4% NaCl濃度; E含6% NaCl濃度; F含7% NaCl濃度;G含8% NaCl濃度。

Note: A is 0% NaCl concentration; B is 1% NaCl concentration; C is 2% NaCl concentration; D is 4% NaCl concentration; E is 6% NaCl concentration; F is 7% NaCl concentration; G is 8% NaCl concentration.

2.5 菌株NYCS1-5對玉米的耐鹽促生能力測定

圖5 菌株NYCS1-5對玉米的促生作用

注：CK為對照組，無菌無NaCl；CB組為有菌無NaCl；CS組為無菌有NaCl；CBS組為有菌有NaCl。A, B, C, D為第4 d生長狀況；E, F, G, H為第10 d生長狀況；I, J, K, L為第12 d生長狀況。

Note: CK was the control group, without NaCl and strain 1-5; CB group had strain 1-5 without NaCl; The CS had NaCl without strain 1-5. The CBS had strain1-5 and NaCl. A, B, C and D are the growth conditions on the fourth day; E, F, G and H are the growth conditions on the tenth day; I, J, K and L are the growth conditions on the twelfth day.

菌株NYCS1-5對玉米具有一定的耐鹽促生功能，玉米植株生長結果見圖5，促生指標見圖6。

注：A第4 d株高；B為第四天根長；C為第10 d株高；D為第10 d根長；E為第12 d株高；F為第12 d根長。

Note: A represents height of the fourth day; B represents root length of the fourth day; C represents height of the tenth day; D represents root length of the tenth day; E represents height of the twelfth day; F represents root length of the twelfth day.

在玉米生長第4 d時，生理株高方面，與CK相比，CB組、CS組和CBS組分別減少了0.17%、50.51%（達到顯著差異，＜0.05）和53.79%（達到顯著差異，＜0.05）。在根長方面，與CK相比，CB組、CS組和CBS組分別減少了14.48%（達到顯著差異，＜0.05）、27.65%（達到顯著差異，＜0.05）和34.89%（達到顯著差異，＜0.05）。根據第4 d測得數據分析可得：在幼苗生長初期，菌株1～5在無NaCl和有NaCl的條件下，對玉米生長都表現出了一定的抑制作用。

在玉米生長第10 d時，生理株高方面，與CK組相比，CB組增加了7.19%；與CS相比，CBS組增加了21.36%（達到顯著差異，＜0.05）。在根長方面，與CK組相比，CB組增加了3.30%；與CS相比，CBS組增加了14.48%（達到顯著差異，＜0.05）。根據第10天測得的數據分析可得：在無NaCl和有NaCl條件下，菌株1～5對玉米幼苗有一定促生作用，并且在有NaCl條件下，促生作用更顯著。

在玉米生長第12 d時，生理株高方面，與CK組相比，CB組增加了17.38%（達到顯著差異，＜0.05）；與CS相比，CBS組增加了17.90%（達到顯著差異，＜0.05）。在根長方面，與CK組相比，CB組增加了1.58%；與CS組相比，CBS組增加了12.02%。根據第12 d測得的數據分析可得：在無NaCl和有NaCl條件下，菌株1-5對玉米幼苗有一定促生作用，并且在生理株高方面促生作用更顯著。

3 討論

對前期保藏的原始菌株NYCS1-5經過菌落及細胞形態鑒定、生理生化鑒定，16S rDNA測序及系統發育樹分析，將該菌株鑒定為棲稻假單胞菌()。該菌可以利用多種碳源，具有解鉀、解磷、溶磷和產生長素能力，有助于土壤養分活化及促進植物生長，是潛在的PGPR菌株。

磷是作物生長的必需元素，也是經常使用的化肥。土壤中磷元素含量比較高，但是大多是不能被植物利用的固化的有機和無機磷[32]，而我們篩選到的菌株NYCS1-5同時具有活化有機和無機磷的能力，對活化土壤中的磷元素，減少磷肥的使用意義重大。

目前國內對于棲稻假單胞菌的耐鹽促生實驗研究較少。鄒路路[33]將來自昆明核桃疫病幼果的棲稻假單胞菌YKW14進行實驗，發現菌株YKW14在LB培養基平板上生長良好，在含有2% NaCl的培養基上不能生長，而我們分離的菌株NYCS1-5可以耐受7%的NaCl濃度，可在高鹽條件下生存，也在促進植物耐鹽生長方面具有較好的應用潛力。我們實驗室首次研究了棲稻假單胞菌對玉米的耐鹽促生能力，菌株NYCS1-5在0 mmol/L NaCl、100 mmol/L NaCl對玉米的生理株高和根長方面都有促生作用，并且在100 mmol/L NaCl條件下，對玉米的促生作用更顯著，具有耐鹽促生功能，初步推斷NYCS1-5可能為一種耐鹽菌，并且可以和玉米建立一種互利共生關系，使得菌株在一定高鹽濃度下可以促進玉米的生長。未來可采用盆栽和田間試驗進一步揭示菌株NYCS1-5的耐鹽促生功能并在分子水平上揭示部分促生機理，以增強菌株的應用性。

4 結論

本實驗鑒定出一株棲稻假單胞菌（）NYCS1-5，具有溶磷、解磷、解鉀以及產IAA能力，是PGPR的重要成員。菌株NYCS1-5的耐鹽能力也可達到7%，可在高鹽條件下發揮對植物的促生作用；菌株NYCS1-5對玉米幼苗有促生作用，并且在有100 mmol/L NaCl存在的條件下促生作用更顯著。綜上，棲稻假單胞菌NYCS1-5在土壤磷元素活化和促進植物耐鹽生長等方面具有實際應用價值。

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Identification of a StrainNYCS1-5 and Its Growth-promoting Function for Maize on High Saline Condition

FENG Jian-ru1, E Wen-hui1*, ZHU Xiu-ling1, ZHOU Chun-yan2, MA Shi-meng1, LI Ming-peng3, DING Yan-qin1, DU Bing-hai1, WANG Cheng-qiang1**

1.271018,2.271018,3.256200,

By carrying out cell and colony morphology identification, physiological and biochemical analysis, salt-tolerant and growth-promoting function and 16S rDNA phylogenetic tree analysis on the Strain NYCS1-5 preserved in our laboratory, this experiment identified the strain as. The results show that NYCS1-5 has organic and inorganic phosphorus solubilizing ability, a certain potassium solution ability and the ability to produce IAA. The salt tolerance range of the strain can reach up to 7%. Through the maize nutrient solution culture experiment, the growth-promoting function of strain NYCS1-5 on maize under salt (100 mmol/L NaCl) and salt-free conditions was also studied. The growth status of plant height and root length of maize on the 4th, 10th and 12th day of growth were recorded. Under salt conditions, when maize was grown for 10 days, the physiological plant height and root length of maize in the treatment group of strain NYCS1-5 increased by 21.36% and 16.64%, respectively, which reached a significant difference. The strain NYCS1-5 showed salt-tolerant and growth-promoting function of maize. Under salt-free conditions, the strain NYCS1-5 also showed a certain promotion effect on the physiological plant height and root length of maize. When the maize was grown for 12 days, the physiological plant height of maize in the treatment group of strain NYCS1-5 increased by 17.38%, reaching a significant difference. In summary,NYCS1-5 has salt-tolerant and growth-promoting application value for maize and other crops.

; strain identification; maize; salt tolerance and growth promotion

Q939.11+2

A

1000-2324(2021)05-0723-08

2021-07-22

2021-09-10

國家自然科學基金項目(31700094,31770115);國家重點研發計劃項目(2017YFD0200804)

馮健茹(2000-),女,在讀本科生,主要從事環境微生物研究. E-mail:fengjr1110@163.com

*同等貢獻作者: 俄文慧(1994-),女,在讀碩士研究生,主要從事環境微生物研究. E-mail:wenhuiE2020@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:wangcq@sdau.edu.cn