細菌及真菌血流感染宏基因組學檢測標本預處理方法探索*

朱 盈，楊啟文

1.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科,北京 100730；2.中國醫學科學院北京協和醫學院，北京 100730

近年來，由于靜脈導管留置、機械通氣、腸外給藥等侵入性設備及治療的廣泛應用,免疫抑制劑及大量抗菌藥物的濫用,血流感染的發病率逐年上升[1]。然而，臨床血流感染標本中病原微生物水平較低，部分標本病原菌甚至無法培養，導致標本陽性檢出率較低，臨床診斷困難。宏基因組學近年來被廣泛應用于環境學、農業學等方面的研究。宏基因組學直接從環境樣品中提取全部微生物的DNA,或通過測序探究環境中微生物的群落結構和功能,克服了傳統培養方法的缺陷,極大地豐富了對標本微生物多樣性及其功能的認識[2]。宏基因組學在醫學微生物方面的研究有以下優勢：不受靶標限制、可以預測耐藥性、快速制備文庫和實時采集數據[3]。將宏基因組學測序技術應用于臨床微生物診斷可以全面快速地探索標本中病原菌的分布特征及耐藥基因組學和毒力基因組學的特征。研究有效的去宿主核酸處理方法有助于提高檢測的靈敏度和準確度，減少數據分析困難，并且能在一定程度上降低檢測成本。為此，本研究將臨床常見的3種病原微生物(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌)注入到健康人血液中制備模擬標本，以綜合評估3種標本預處理方法[皂素去宿主核酸法(Saponin法)、SDS去宿主核酸法(SDS法)和水洗法]的去人源核酸效果，旨在對將來的宏基因組學測序技術流程進一步發展及改進提供參考。

1 材料與方法

1.1標本來源 本研究使用臨床模擬血液標本，將健康獻血者含白細胞血漿與懸浮紅細胞按體積1∶1混合，模擬全血標本。實驗菌株使用臨床質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923、白色念珠菌ATCC 90028和臨床肺炎克雷伯菌(R16)。將菌懸液注入到全血標本中，最終得到濃度為103cfu/mL的含菌血液[4]。每份標本進行2次重復平行試驗。

1.2儀器與試劑 核酸提取選用Zymo BIOMICS DNA minipre Kit核酸提取試劑盒。實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)使用羅氏LightCycler?480儀器，選用Takara TB Green Premix Ex Taq 酶或Apllied Biosyetems TaqMan Universal Master Mix Ⅱ試劑進行檢測。在去宿主核酸處理步驟中使用熱不穩定性耐高鹽核酸酶(HL-SAN)(ActicZymes?)、Saponin干粉(Sigma-Aldrich?)、SDS、蛋白酶K凍干粉(Solarbio)。

1.3方法

1.3.1Saponin法[3]取8 mL含菌血液，800 r/min離心5 min，留取血漿，棄下層血細胞；將血漿以9 000 r/min離心5 min，棄上清液，200 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS) 重懸沉淀，再加入200 μL 5% Saponin溶液(終濃度為2.5%)，37 ℃振蕩孵育15 min，孵育過程中每2 min混勻1次，保證中間充分反應；加入350 μL無菌純水，靜置30 s，再加入12 μL NaCl溶液(5 moL/L)，渦旋混勻。8 000 r/min離心5 min，棄上清液，100 μL PBS重懸沉淀，再加入100 μL HL-SAN buffer(5.5 moL/L NaCl，100 mmoL/L MgCl2水溶液)，混勻。加入10 μL HL-SAN，立即混勻，37 ℃ 1 300 r/min孵育15 min；每管加入1 mL PBS，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，1 mL PBS重懸，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，用250 μL PBS重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.2SDS法 取8 mL含菌血液，800 r/min離心5 min，留取血漿，棄下層血細胞；將血漿以9 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入160 μL 無菌PBS 重懸沉淀，再加入80 μL 無菌5% SDS溶液(終濃度為1.6%)，37 ℃振蕩孵育15 min，孵育過程中每2 min混勻1次，保證中間充分反應；加入350 μL無菌純水，靜置30 s，再加入12 μL NaCl溶液(5 mol/L)，渦旋混勻。8 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS洗滌SDS，再以8 000 r/min離心5 min。重復上一步。100 μL PBS重懸沉淀，再加入100 μL HL-SAN buffer，混勻。加入10 μL HL-SAN，立即混勻，37 ℃ 1 300 r/min孵育15 min；每管加入1 mL PBS，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，1 mL PBS重懸，8 000 r/min離心3 min；棄上清液，用250 μL PBS重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.3水洗法 取8 mL含菌血液，3 200 r/min離心30 s，留取血漿，棄下層血細胞；量取血漿于新的5 mL低吸附管內，并加入等體積無菌超純水，渦旋混勻；室溫孵育5 min，期間不斷混勻；13 300 r/min離心2 min；棄上清，250 μL PBS重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.4核酸提取 嚴格按照Zymo BIOMICS DNA minipre Kit核酸提取試劑盒說明書進行核酸提取。

1.3.5qPCR 分別使用nuc[5]、phoE和CALB[6]基因對標本中的金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌進行熒光定量分析。采用GAPDH[7]和β-actin[7]基因對標本中的人源核酸進行熒光定量分析。其中GAPDH、β-actin、nuc、phoE基因的檢測采用探針法qPCR，CALB基因的檢測采用染料法qPCR。均采用25 μL體系，程序設定為95 ℃ 10 min 1個循環：預變性；40個循環(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)：變性，退火，延伸; 40 ℃ 1 s 1個循環：冷卻。具體引物及探針序列見表1。

表1 實驗所用引物和探針

1.4統計學處理 將制備的未去宿主處理和去宿主處理的臨床模擬標本組的核酸作為模板，進行qPCR檢測，獲得各標本中不同目的基因的Ct值。因Ct值與核酸水平呈反比，故比較其Ct值即可對比其中人源核酸及病原菌核酸的數量。按如下公示計算：未進行去宿主處理的標本Ct值-對應的去宿主處理后的標本Ct值=ΔCt

2 結 果

圖1 標本中人源核酸變化

表2 3種方法標本中核酸總體變化

圖2 標本中病原菌基因變化

3 討 論

本研究采用Saponin法和SDS法進行去宿主核酸的原理類似，Saponin和SDS皆為表面活性劑，可以起到裂解細胞膜的作用，因為細菌、真菌均有細胞壁，對細胞膜有保護作用，所以可以針對性地裂解人源細胞膜，暴露人源核酸，并且通過滲透裂解進一步裂解細胞膜，同時使用非特異性核酸內切酶HL-SAN進行核酸降解。由于SDS法對HL-SAN的酶發揮作用有影響，所以在SDS法的流程中增加了洗滌的步驟。水洗法的實驗原理是通過ANSON等[8]實驗中評估的不同離心條件來分離菌體與人類細胞，選擇最佳離心條件，同時使用低吸附管，減少核酸耗損，然后再用等體積無菌純水渦旋、孵育，達到低滲裂解的效果，再離心，分離暴露的人源核酸和完整的菌體，最終達到去宿主核酸的目的。

Saponin法整體效果最優，去宿主核酸處理步驟使病原菌菌體充分暴露，核酸提取效率明顯增加。而SDS法雖有效去除了人源核酸，但病原菌核酸也發生了丟失，判斷可能是因為SDS解構蛋白能力較強，導致在去宿主核酸處理的步驟中，病原菌核酸也發生了丟失。

本研究結果顯示，水洗法去宿主核酸效果劣于Saponin法和SDS法，考慮到操作誤差及檢測中的隨機誤差同時存在于另外兩種方法，故可以排除隨機誤差的影響，認為是方法學的問題：一方面水洗法的步驟較為簡單，低滲裂解比較溫和，核酸去除效果不佳；另一方面去宿主處理后的標本經過了稀釋重懸，在核酸提取步驟中破膜效果更好，核酸提取效率提高。對標本進行水洗法去宿主核酸處理后再提取核酸雖然提高了病原菌核酸提取效率，但同時也提高了人源核酸的提取效率，并且對人源核酸的富集效果優于病原菌核酸，因此，沒有達到理想的去宿主核酸效果。

目前，去宿主核酸處理主要包括細胞處理和核酸處理兩種方法。本實驗中，水洗法利用了人源細胞與菌體的密度差異去除宿主細胞，在人源核酸去除方面效果略差于Saponin法和SDS法。而在關晴輝[9]的研究中，利用人類細胞與細菌直徑的差異，使用過濾膜處理模擬痰標本，最終的去宿主核酸效果與NEB試劑盒相近且耗時更短。細胞處理法試劑耗材少、成本低、耗時短，值得進一步研究優化。

核酸層面的處理方法包括商品化試劑盒、滲透壓裂解細胞膜和細胞裂解液(Saponin、Triton X-100、吐溫-20)等。MAROTZ等[10]研究表明，滲透壓裂解細胞膜的效果比較差，不宜單獨使用，但可以在實驗流程中配合其他細胞裂解液使用以提高去宿主核酸效率。PMA、Saponin、Triton-100、吐溫-20等均為表面活性劑，能夠裂解膜蛋白，配合核酸內切酶(HL-SAN、Turbo DNase等)使用可以達到去宿主核酸效果[10-15]，本研究中Saponin法和SDS法就是采用該原理，聯合使用滲透壓裂解液、表面活性劑和核酸內切酶，證明該方法可行且效果較好。

本方案還有待改進，下一步實驗應考慮將方案應用于真實多樣的臨床標本，并采用宏基因組學測序對去宿主核酸處理方法的靈敏度、重復性和特異性進行驗證，同時對于Saponin及SDS裂解液的水平還可以進一步進行探索。盡可能提高方法的檢測下限及排除干擾是分子診斷技術將來的發展方向。檢測下限降低能夠保證檢測方法的靈敏度，并且在患者發病早期甚至還未發病前進行預測診斷，提前干預，減少不恰當的診療。而高靈敏度的檢測方法帶來的也可能是更多的干擾信息，環境中諸多的污染菌群及人體定植菌群極易混入檢測標本中，規范標本采集技術、縮短標本周轉時間、提高臨床結果判讀能力是解決該問題的關鍵。對于背景更復雜的其他標本(如痰液、肺泡灌洗液等)，各種方法的處理流程及效果尚需進一步探討。且本研究未將病毒納入研究對象，在之后的研究中可以考慮擴大研究范圍，全面探索細菌、真菌及病毒感染標本的去宿主處理方法。

未來的去宿主處理方法可以從技術層面研究新方法，降低人源細胞的干擾，富集病原菌，提高檢出率。同時，還可以探索新物質，尋找更高效的去除標本中人類細胞或核酸的試劑或酶，或者尋找新的方法，在盡可能剔除人源細胞或核酸的基礎上，減少病原菌核酸丟失。解決標本前處理問題，提高標本中病原菌核酸占比，能進一步推動宏基因組學測序技術在病原微生物診斷及預測方面的應用，最大限度地縮短病原菌鑒定及耐藥基因檢測的時間。快速準確的血流感染診斷、及時高效的耐藥基因篩查能夠幫助臨床醫生盡早選擇適當的抗菌藥物進行治療，改善治療療效，減少臨床不恰當的經驗用藥案例，為臨床診療提供極大的便利。同時，隨著病原菌基因組學研究的進一步深入，臨床對于耐藥基因的認識也會越來越深，使用宏基因組學測序技術可以更快、更全面地獲得菌株耐藥信息，幫助臨床優化抗菌藥物管理，對應對突發流行性疾病十分重要。同時也能為宏基因組學測序技術在其他方面的應用提供思路，如腫瘤DNA檢測、流行病學調查研究等。