BMP9對共培養體系中人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響及其機制探討*

王 林，段雯婷，王 維

1.陜西省西安市第一醫院檢驗科，陜西西安 710002；2.陜西省西安市第一醫院心血管內科， 陜西西安 710002；3.陜西省西安市兒童醫院檢驗科，陜西西安 710003

骨是包括乳腺癌在內的多種癌癥遠處轉移的常見部位，幾乎所有晚期乳腺癌患者均會發生骨轉移[1-3]。骨轉移常表現為溶骨性病變，導致病理性骨折、頑固性骨痛、神經壓迫和高鈣血癥[4]。發生骨轉移的乳腺癌組織中來源于骨髓的間充質干細胞(BMSCs)，為乳腺癌細胞的生長提供了良好的微環境。有研究發現，BMSCs與乳腺癌細胞(BCCs)的相互作用是乳腺癌骨轉移和骨溶解的重要環節[5]，深入了解這種相互作用及潛在的機制有助于探究乳腺癌的治療新策略。骨中存在多種生長因子，包括骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子-β(TGF-β)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板源性生長因子和胰島素樣生長因子[6]，這些因子也被稱為骨儲存生長因子或骨衍生生長因子，其中TGF-β的促乳腺癌骨轉移作用已經明確。TGF-β通過Smad信號通路促進乳腺癌細胞中甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)的分泌。PTHrP通過上調破骨細胞激活因子促進破骨細胞的形成和骨質破壞[7]。但是,對于其他骨生長因子的功能和分子機制有待進一步研究。BMP9是一種骨儲存生長因子，被證實為骨形成過程中最有效的BMP[8-9]。前期實驗結果顯示，BMP9能抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移[10]，然而BMP9對骨微環境中的乳腺癌細胞的作用尚不明確。本研究體外模擬腫瘤微環境，在人乳腺癌MDA-MB-231細胞和人骨髓基質HS-5細胞共培養體系中加入BMP9，研究BMP9如何調節BMSCs和BCCs的相互作用，以探索乳腺癌骨轉移的治療新靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 人乳腺癌細胞MDA-MB-231購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學細胞生物學研究所，人骨髓基質細胞HS-5購于美國菌種保藏中心，均由西安市第一醫院檢驗科保存。

1.2儀器與試劑 重組BMP9購于Abcam生物試劑有限公司；DMEM高糖培養基購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白緩沖液和封閉蛋白購于武漢博士德生物工程有限公司；蛋白marker購于北京賽百盛基因技術有限公司；細胞裂解液購于碧云天生物技術研究所；Transwell小室和辣根過氧化物酶(HRP)發光試劑購于Millipore公司；Matrigel膠購于Sigma公司；兔抗人趨化因子受體4(CXCR4)抗體購于Abcam 公司；兔抗人基質細胞衍生因子-1(SDF-1)抗體購于Santa Cruz公司；兔抗人P-Akt、Akt抗體購于Cell Signaling Technology公司；兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)9、MMP2抗體購于Immunoway公司；山羊抗兔IgG二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養 MDA-MB-231細胞和HS-5細胞用含10 %胎牛血清的DMEM高糖培養基在37 ℃,50 mL/L CO2的條件下進行培養。

1.3.2共培養及實驗分組 取常規培養對數生長期的MDA-MB-231細胞和HS-5細胞，分別以1.5×105/孔和1×105/孔細胞數量接種于6孔板中和Transwell小室中在37 ℃,50 mL/L CO2中進行單獨培養16 h后，兩種細胞更換為DMEM無血清培養基，并將小室置于6孔板內進行共培養，對照組在共培養體系中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，實驗組給予100 ng/mL BMP9蛋白處理。

1.3.3細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 接種MDA-MB-231細胞于6孔板中，待細胞共培養前，用100 μL移液器槍頭垂直劃痕，并記錄0 h劃痕寬度，然后將MDA-MB-231細胞與HS-5細胞疊放進行共培養，顯微鏡觀察36 h同一視野劃痕愈合情況，計算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-36 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，以此反映細胞遷移能力的變化，實驗重復3次。

1.3.4Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 預先在每孔Transwell細胞上室加入50 μL Matrigel膠(DMEM無血清培養基1∶8稀釋)，37 ℃ 30 min待凝固。對照組和實驗組共培養48 h后的MDA-MB-231細胞經胰酶消化離心后，分別用各自共培養體系中培養液重懸，以5×104/孔的濃度取400 μL加入上室，下室分別加入600 μL各自共培養體液的培養液，繼續培養24 h，取出小室用PBS清洗2遍，自然晾干后經結晶紫染色5 min，于顯微鏡下觀察計數穿膜細胞數，以反映細胞侵襲能力的變化，實驗重復3次。

1.3.5Western blot檢測BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞MMP2、MMP9、CXCR4、SDF-1、P-Akt及HS-5細胞SDF-1表達的影響 按試劑盒要求分別提取對照組和實驗組共培養48 h后的MDA-MB-231細胞和HS-5細胞總蛋白，取120 μg總蛋白行10% SDS-PAGE進行分離后干轉至聚偏氟乙烯膜，經三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽吐溫緩沖液(TBST)(含50 g/L脫脂奶粉)4 ℃封閉4 h后，分別加入經1∶1 000稀釋的兔抗人MMP9、MMP2、CXCR4、SDF-1、P-Akt抗體(MDA-MB-231細胞)，兔抗人SDF-1抗體(HS-5細胞)，于4 ℃孵育過夜，經TBST洗滌2次和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液洗滌1次；加入經1∶1 000稀釋的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h,重復洗滌；暗室滴加HRP發光試劑2 min后經Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像，用Quantity One 4.6.6軟件進行各條帶灰度值分析，并用內參作比值，以檢測各蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.3.6明膠酶譜法檢測BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞MMP2、MMP9相對活性的影響 收集對照組和實驗組共培養48 h后的MDA-MB-231細胞上清液，經2 000 r/min離心10 min備用，配置分離膠和濃縮膠，根據蛋白水平調整上樣量，與5×緩沖液混合上樣，于4 ℃行SDS-PAGE，將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次，每次40 min，漂洗液漂洗2次,每次40 min，然后將凝膠置于孵育液于37 ℃ 孵育42 h，孵育結束后經染色液染色3 h，以及脫色液A、B、C分別脫色0.5、1.0、2.0 h，用Quantity One 4.6.6軟件分析藍色背景MMP2(相對分子質量72×103)、MMP9(相對分子質量92×103)透亮帶寬度和灰度值，做統計分析，實驗重復3次。

2 結 果

2.1BMP9可抑制共培養體系中MDA-MB-231細胞的遷移 劃痕實驗結果顯示，對照組和實驗組共培養體系中MDA-MB-231細胞平均愈合率分別為(84.28±2.54)%、(44.49±4.86)%，差異有統計學意義(t=12.58，P<0.05)。見圖1。

圖1 劃痕實驗檢測BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞遷移的影響(×100)

2.2BMP9可抑制共培養體系中MDA-MB-231細胞的侵襲 Transwell細胞侵襲實驗結果顯示，對照組和實驗組共培養體系中MDA-MB-231細胞穿膜細胞數分別為481±22、121±11，差異有統計學意義(t=24.96，P<0.05)。見圖2。

2.3BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞MMP9、MMP2表達及相對活性的影響 Western blot檢測結果顯示，實驗組MMP9的蛋白表達(0.10±0.01)較對照組(0.79±0.03)明顯下調，MMP2的蛋白表達(0.11±0.03)較對照組(0.82±0.05)也明顯下調，差異均有統計學意義(t=34.99、19.04，P<0.05)，見圖3；明膠酶譜檢測結果顯示，實驗組MMP9相對活性(0.14±0.03)較對照組(0.90±0.07)明顯下調，MMP2相對活性(0.12±0.02)較對照組(1.04±0.14)也明顯下調，差異均有統計學意義(t=17.24、11.15，P< 0.05)，見圖4 。

圖2 Transwell細胞侵襲實驗檢測BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞侵襲的影響(×200)

圖4 明膠酶譜法檢測BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞MMP9、MMP2相對活性的影響

2.4BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞及HS-5細胞SDF-1/CXCR4-PI3K信號通路關鍵分子表達的影響 Western blot檢測結果顯示，實驗組MDA-MB-231細胞中CXCR4受體蛋白表達(0.08±0.01)與對照組(0.07±0.01)比較，其配體SDF-1的蛋白表達(0.06±0.02)與對照組(0.05±0.01)比較，差異均無統計學意義(t=2.00、0.80，P>0.05)；實驗組P-Akt蛋白表達(0.09±0.01)較對照組(0.48±0.07)明顯降低，差異有統計學意義(t=9.68，P<0.05)；而實驗組Akt蛋白表達(0.40±0.05)與對照組(0.46±0.03)比較，差異無統計學意義(t=1.70，P>0.05)。實驗組HS-5細胞中SDF-1蛋白表達(0.14±0.01)較對照組(0.42±0.06)明顯降低，差異有統計學意義(t=7.93，P<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot檢測BMP9對共培養體系中MDA-MB-231細胞及HS-5細胞SDF-1/CXCR4-PI3K信號通路關鍵分子表達的影響

3 討 論

腫瘤包括乳腺癌在內，不是以自我維持的實體方式存在，而是不斷地與其微環境相互作用[11-12]。BMSCs作為腫瘤微環境的重要組成部分，不管是在原發性癌還是骨轉移性癌中均可與BCCs發生相互作用。BCCs可在乳腺癌早期招募BMSCs至其原發部位[5]。越來越多的證據表明，BMSCs與BCCs的相互作用在乳腺癌轉移過程中扮演著關鍵角色[13-14]，另外二者的交互對乳腺癌晚期所致的骨骼損傷過程有促進作用[15]。因此，腫瘤微環境中細胞的相互作用可能是治療乳腺癌的潛在靶點。

BMP9也被稱之為生長分化因子2，與包括乳腺癌在內的多種腫瘤的生長、黏附、侵襲和遷移有關。BMP9可通過BMP/SMAD途徑促進卵巢癌細胞的生長[16]，也可通過非經典BMP/SMAD途徑抑制前列腺癌PC-3細胞的生長及促進其凋亡[17]。有研究表明，BMP9可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲[9]。BMP9是最有效的成骨因子，可能比目前臨床上使用的其他BMP有更好的促進骨再生的作用[8-9]。另外，作為一種分泌性蛋白，BMP9是骨髓中重要的骨相關分子，然而，其在乳腺癌骨轉移中的作用尚不明確。有研究結果顯示，BMP9通過阻斷Akt信號通路降低HS-5細胞的細胞核因子κB受體活化因子配基的分泌，進而抑制MDA-MB-231細胞的侵襲[9]。

本研究建立HS-5細胞和MDA-MB-231細胞共培養模型，體外模擬腫瘤微環境，研究BMP9如何調節BMSCs與BCCs的相互作用。BMP9對MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲有明顯抑制作用。轉移相關蛋白SDF-1和MMPs表達明顯減少，然而，BMP9調控這些轉移相關因子的機制還有待進一步研究。不同癌癥對BMP9的反應不同，有文獻報道BMP9在卵巢癌中與本研究相反的作用[16]。BMP9的致瘤或抑瘤特性反映了其在該腫瘤發育過程中與BCCs復雜的相互作用過程，BCCs對BMP9的生物學反應亦取決于其劑量、細胞類型和腫瘤微環境，以及其他尚未確定的因素。SDF-1又稱為CXCL12，在HS-5細胞中呈高度表達，而其受體CXCR4在MDA-MB-231細胞中呈高度表達。本課題進一步研究BMP9對共培養體系SDF-1/CXCR4軸的影響，結果表明，BMP9降低了HS-5細胞中SDF-1的分泌，而對MDA-MB-231細胞中CXCR4的表達無影響，同時MDA-MB-231細胞下游信號分子P-Akt表達降低。

綜上所述，BMP9可抑制體外模擬腫瘤微環境的共培養體系中乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲，其作用可能是通過調節共培養體系中SDF-1/CXCR4-PI3K信號通路實現的，為乳腺癌的生物治療提供了新的靶點及實驗依據，下一步課題組將進行相關體內研究來進一步證實其推斷。