EDTA依賴性假性血小板減少癥的不同檢測方法比較

蔡麗秀，張蛟鯊，張 錦，包艾平，付 陽

1.四川省成都市雙流區第一人民醫院/四川大學華西空港醫院醫學檢驗科, 四川成都 610200；2.四川大學華西醫院實驗醫學科，四川成都 610041

血小板計數在血栓和出血性疾病的診斷和治療中有重要價值。國際血液學標準化委員會推薦使用乙二胺四乙酸(EDTA)作為血常規檢測的抗凝劑，因其對血細胞的形態和血小板計數影響很小，因此被廣泛使用[1]。然而EDTA也有其弊端，有時會導致血小板聚集，因為儀器對聚集的血小板不能確認，造成EDTA依賴性假性血小板減少癥(EDTA-PTCP)[2]。這種血小板假性減少現象若沒有及時發現并糾正，臨床上則可能采取非必要的骨髓穿刺、激素治療或施行脾臟切除術等治療方案[3]。因此，工作中能及時發現 EDTA-PTCP患者并準確進行血小板計數復檢尤為重要。本研究對成都市雙流區人民醫院醫學檢驗科工作中發現的18例EDTA-PTCP患者，采用不同血小板計數方法評價其準確性，為實驗室尋找快速、準確的EDTA-PTCP復檢方法提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年5-8月成都市雙流區第一人民醫院18例EDTA-PTCP患者標本，其中男6例，女12例；年齡2～78歲，平均46歲。分別來自住院部9例(50.0%)，門診4例(22.2%)，體檢科5例(27.8%)。

1.2納入標準 (1)血小板計數≤70×109/L；(2)EDTA抗凝標本血小板計數隨著時間的推移呈進行性減低；(3)外周血涂片血小板聚集。

1.3儀器與試劑 (1)中國邁瑞(BC-6900)全自動血細胞分析儀及原裝試劑；(2)日本Olmpus CX23顯微鏡；(3)EDTA-K2抗凝真空采血管及無抗凝劑的紅色真空管、子彈頭(康健醫療用品有限公司，中國江蘇)；(4)血小板計數溶血劑(凱諾威生物科技有限公司，中國成都)；(5)瑞氏-吉姆薩染液(貝索公司，中國珠海)。

1.4方法

1.4.1手工法 準確采集所有患者末梢血20 μL，擦去管外余血，加至380 μL的血小板計數溶血劑中，充分混勻后室溫靜置，待完全溶血后再次混勻，充入2個計數池內，靜置10～15 min，待血小板下沉后顯微鏡下計數2個計數池內的血小板數量，取平均值。

1.4.2儀器稀釋法 抽取所有患者靜脈血2 mL于無抗凝劑的真空管中，立刻吸取40 μL血液加入140 μL的邁瑞BC-6900全自動血細胞分析儀稀釋液中，1～18例標本采用儀器稀釋阻抗法測血小板法(PLT-I)上機檢測，10～18例標本額外再采用儀器稀釋光學法測血小板法(PLT-O)上機檢測，記錄血小板數量。因儀器稀釋法在本實驗室為采血稀釋后0～5 min內上機檢測，所以未進行時間分組。

1.4.3PLT-I 采集所有患者EDTA-K2抗凝全血標本，充分混勻后分別于不同時間點(0～5 min、20 min、1 h、2 h)采用PLT-I檢測血小板，記錄4個時間點的血小板計數結果。

1.4.4PLT-O 對1.4.3中采集的血液標本于1 h內采用PLT-O檢測血小板，記錄1 h內PLT-O的血小板計數結果。補充實驗：10～18例標本補充了PLT-O的檢測時間點，在0～5 min、20 min、1 h、2 h內采用PLT-O檢測血小板，記錄PLT-O檢測的血小板計數結果。對每份標本進行涂片染色，并觀察血小板聚集情況。

2 結 果

2.118例標本不同檢測方法及不同時間點血小板計數結果比較 隨著時間的推移，EDTA-K2抗凝管PLT-I血小板檢測數量呈進行性下降，但下降程度與時間存在個體差異，1 h內PLT-O檢測血小板計數明顯高于PLT-I，見圖1。

圖1 18例標本不同檢測方法及不同時間點血小板計數結果比較

2.2不同檢測方法血小板計數的準確率比較 準確率最高的方法是用EDTA-K2抗凝管全血0～5 min內采用PLT-I上機檢測，準確率為77.8%；其次是儀器稀釋法，準確率為72.0%；EDTA-K2抗凝全血1 h內PLT-O的準確率也較高，為61.0%。EDTA-K2抗凝全血1 h內的準確率PLT-O明顯高于PLT-I。見表1。

表1 不同檢測方法血小板計數的準確率比較(%,n=18)

2.3補充實驗中10～18例標本手工法與PLT-O血小板計數結果比較 補充實驗中10～18例EDTA-K2抗凝標本PLT-O血小板計數隨時間呈進行性下降，隨著血小板聚集程度加重，PLT-O準確檢測血小板的能力呈下降趨勢，見圖2。

圖2 補充實驗中10～18例標本手工法與PLT-O血小板計數結果比較

2.4外周血涂片鏡檢結果 通過外周血涂片鏡檢，所有EDTA-K2抗凝全血標本隨時間推移均發生血小板聚集，且聚集程度隨時間呈加重趨勢，見圖3。

2.5PLT-O不同時間點準確率比較 補充實驗中10～18例標本準確率最高的方法是用EDTA-K2抗凝管采全血后0～5 min內采用PLT-O上機檢測，準確率為100.0%，其次為采血后20 min內上機檢測及儀器稀釋后0～5 min內采用PLT-O檢測，準確率均為77.8%，見表2。

圖3 EDTA-K2抗凝全血血小板聚集情況(瑞氏-吉姆薩染色，×1 000)

2.6血小板形態 通過外周血涂片鏡檢發現第2例EDTA-PTCP住院患者血小板形態異常，隨著病情恢復，血小板未再發生聚集，形態也恢復正常，其余17例患者血小板形態均正常，見圖4。

圖4 EDTA-PTCP患者血小板形態(瑞氏-吉姆薩染色×1 000)

表2 PLT-O不同時間點準確率比較(%,n=9)

3 討 論

EDTA-PTCP似乎與年齡和性別無關，是否與特定的疾病和藥物相關也無明確結論，存在于健康受試者和各種疾病患者中[4-6]。本研究中住院患者占50.0%，門診患者占22.2%，體檢者占27.8%，最小年齡為2歲，最大年齡為78歲，存在于各種疾病患者中。但部分EDTA-PTCP患者因血小板還未明顯聚集已上機檢測，導致無法及時發現，特別是門診患者。成都市雙流區第一人民醫院要求30 min內審核報告，從圖1可以看出，部分患者采血后30 min內已上機檢測，其血小板計數大于100×109/L，這部分患者很難被發現，所以實際發生率可能更高。

目前，EDTA-PTCP的發生機制并不明確，主要有以下原因：(1)與自身抗體相關。自身抗體與血小板上的隱匿性抗原結合，導致血小板發生聚集，這種自身抗體可以是抗血小板抗體，也可以是抗心磷脂抗體。(2)與血小板上的隱匿性抗原相關。EDTA與Ca2+鰲合，導致血小板的結構發生改變，暴露出隱匿性抗原，抗原與抗血小板抗體結合，導致血小板聚集。(3)與血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa相關。GPⅡb/Ⅲa之間存在神秘表位，GPⅡb/Ⅲa需要Ca2+保持其二聚體結構，EDTA與Ca2+鰲合導致其結構發生變化，從而導致表位暴露在GPⅡb上，與抗血小板抗體結合發生聚集。但 EDTA依賴性抗體并不特異，除EDTA-PTCP外，也觀察到EDTA依賴性白細胞聚集[11]。盡管目前的研究從不同角度闡述了各自的理論，但尚不能全部解釋其發生機制。從圖4可以看出,第2例EDTA-PTCP患者血小板形態異常，隨著病情的恢復，當血小板未再發生聚集時血小板形態恢復正常，但無法明確是否與用藥或者其他治療相關。

針對EDTA-PTCP目前提出了諸多解決方法，主要分為兩類。第一類是不需要二次采血的方法，主要有加入阿米卡星及振蕩法等，加入阿米卡星能較好地解聚血小板，但等待解聚的時間較長，且靈敏度和特異度存在個體差異[7-10]；抽血后1 h內加入6.5 mg/mL阿米卡星能有效解聚血小板，但文獻[11-12]的標本僅有2例，是否存在不能解聚的情況還需進一步研究；振蕩法比較簡便快速，但不能解聚血小板的概率高，且振蕩后破碎紅細胞也會對血小板的測定造成干擾[13]。第二類是需要二次采血的方法，主要有手工法、儀器稀釋法、抗凝劑替代法等，目前手工法仍是血小板計數的金標法，缺點是操作復雜、耗時長；儀器稀釋法準確，但因無抗凝劑的參與，采血稀釋過程中容易發生血液凝固導致血小板減低[10]；抗凝劑替代法是目前最常用的方法，但多種抗凝劑依賴的患者不能采用此法。根據近來報道，邁瑞血細胞分析儀網織通道檢測血小板效果較理想，邁瑞BC-6800和BC-6900全自動血細胞分析儀PLT-O具有血小板解聚功能[14]，血小板聚集標本與反應溶液(解離試劑)在42 ℃的恒溫條件下混合，然后在1 400 r/min的高速渦旋中進行攪拌，在劇烈振蕩中對血小板聚集的物理結構進行機械破壞，并通過檢測系統逐一檢測。在這種情況下，血小板聚集迅速有效地解離，血小板使用光學方法被準確計數，通過此方法能較好地解決EDTA-PTCP，但目前的研究并未對PLT-O進行時間分組[15-16]。

本研究在前階段實驗中發現，即使采用PLT-O檢測血小板，其計數仍會隨著時間呈下降趨勢，所以進行了補充實驗，在10～18例標本中對PLT-O進行了時間分組，最終發現PLT-O優于PLT-I，而PLT-O中，采血后0～5 min內采用PLT-O上機檢測的準確率為100.0%，故針對接受二次采血的非急重癥患者，推薦使用此法。未加抗凝劑的儀器稀釋后PLT-O雖然準確率為78.0%，10～18例標本中有2例偏差大于12.5%，但均為PLT-O大于手工法，考慮這其中存在隨機誤差，故對于靜脈穿刺較難的嬰幼兒和重癥患者，采集末梢血儀器稀釋后采用PLT-O為一種較好的方法。PLT-O隨著標本放置時間延長，準確率呈下降趨勢，這似乎與血小板聚集的嚴重程度相關，當血小板聚集特別嚴重時PLT-O準確率較低。18例標本1 h內PLT-O準確率為61.0%，但全部標本血小板計數均大于70×109/L，2020年中華醫學會內科學會發布的《中國成人血小板減少癥診療專家共識》指出，腰椎穿刺需要PLT≥40×109/L，肝臟活檢需要PLT≥50×109/L，腎活檢需要PLT≥100×109/L，牙科手術需要PLT≥(30～50)×109/L，一般大手術需要PLT≥50×109/L。故對于急需手術的患者，采血后1 h內采用PLT-O上機檢測血小板仍為較好的一種方法，既為手術爭取了時間，也不易導致誤診。

本研究通過鏡檢發現，部分患者即使采血后立即上機檢測同樣發生了血小板聚集，而采血后0～5 min內PLT-O準確率為100.0%，PLT-I為77.8%，PLT-O在一定程度上解決了這一問題，但因為病例有限，是否存在采用此法不能解決的患者還有待進一步收集數據驗證。 本研究對邁瑞-6900全自動血細胞分析儀PLT-O進行時間分組實驗，因EDTA-PTCP個體差異較大，用均值和標準差來對比血小板計數不能準確反映出方法的準確性，故本研究最終采用準確率來評估方法的準確性。但本研究最準確的方法仍不能避免二次采血，如何能快速、準確又不需要二次采血的解決這一問題還需繼續研究。

綜上所述，對于EDTA-PTCP患者，最準確的檢測血小板計數的方法為采血后0～5 min內采用PLT-O上機檢測，可有效縮短檢測時間及減少誤診的方法為1 h內采用PLT-O上機檢測。所以本科室針對EDTA-PTCP患者制訂了以下復檢方案：針對不是急查血小板計數的EDTA-PTCP患者，采血后0～5 min內采用PLT-O上機檢測；對于靜脈穿刺較難的嬰幼兒和重癥患者，采集末梢血儀器稀釋后采用PLT-O上機檢測；對于急查血小板計數的患者，采血后1 h內采用PLT-O上機檢測。