致對蝦肝胰腺壞死病副溶血弧菌熒光定量PCR 檢測方法的建立

陳平亞，張亮亮，吳少榮，黃紀徽，王綏家，吳山楠

（海口海關技術中心，海南 海口 570311）

【研究意義】對蝦急性肝胰腺壞死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND）是一種細菌性病害，通常在放苗35 d 左右暴發，病死率高，曾造成我國海南、廣東、福建和廣西對蝦養殖場大面積發病。該病一般在高溫干旱季節的高鹽、高堿養殖池中具有較高的發病幾 率［1］。斑節對蝦（Penaeus monodon）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）和中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）都是 AHPND 的易感種群［2］。患病對蝦出現空腸空胃或腸斷節，肝胰腺萎縮或腫大、呈紅褐色或發白，甲殼變軟等癥狀，死亡率極高。AHPND 的組織學病理特征是肝胰腺上皮細胞脫落，由于血細胞活動形成黑色素沉積，在該病晚期肝胰腺內的黑點更加明顯，并有大量血細胞聚集［3-4］。AHPND 病原菌是一種攜帶PVA1 毒素質粒的嗜鹽海洋性副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND）。嗜鹽海洋性副溶血性弧菌與已知的副溶血性弧菌分離株的基因不同，這種新菌株攜帶一個或多個染色體外PVA1 質粒。并非所有副溶血弧菌都表現出AHPND 致病性［5］，PVA1 質粒攜帶編碼毒素蛋白的基因卻能夠導致AHPND。因此依據PVA1 質粒設計特異性引物和探針對嗜鹽海洋性副溶血性弧菌的檢測十分必要。

【前人研究進展】對VpAHPND全基因組測序發現，其攜帶了約 69 kb 大小的毒力質粒，包含一組共軛轉移基因和兩個質粒啟動基因，是一種自傳遞的質粒［6-7］。毒力質粒具備質粒解離后致死系統，可防止質粒在后代細胞中發生丟失，這種毒性質粒可通過接合傳播，并可在受體中永久遺傳［8］。基因敲除或自然缺乏Pir毒素基因，可使菌株明顯喪失致病能力，因此推斷Pir 毒素可能是AHPND 的主要致病因子。該質粒能編碼表達轉座酶、類病毒蛋白PirA、pirB等毒素蛋白質，pirB毒素主要決定副溶血弧菌的毒力，PirA致病力相對較弱［9］。AHPND 質粒攜帶株的質粒拷貝數在很低的情況下分泌的毒素對對蝦的致病性很高，說明毒素蛋白的分泌不取決于該質粒的拷貝數［10］。具有pirB基因但缺失PirA基因的突變菌不會引起AHPND 病害，但對對蝦仍有40%的致病性［11-12］。

【本研究切入點】本研究針對pirB基因設計特異性引物和探針，對AHPND 進行檢測。由于甲殼動物缺乏特異性免疫機制，AHPND 缺乏有效的防治措施［13］，因此及早檢測和診斷水產動物是否被感染，并采取相應措施防止該病毒繼續擴散，是水產養殖減少損失的有效途徑。【擬解決的關鍵問題】AHPND 的常規 PCR 檢測方法是以pirAvp毒力基因為靶基因來檢測VpAHPND，通過檢測pirA毒力基因拷貝數實現對VpAHPND的定量檢測，從而分析病原菌的侵染途徑，但pirA毒力基因的分子檢測結果陽性強度低，本試驗以pirB毒力基因為靶基因建立實時熒光PCR 方法，以期有效檢測VpAHPND。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株由海口海關技術中心動物實驗室分離保存，包括VpAHPND-HK190423 株、單增李斯特菌Listeria monocytogenes、糞 腸球菌Enterococcus faecalis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、福氏志賀氏菌Shigella flexneri、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、大腸埃希氏菌Escherichia coli、阪崎腸桿菌Enterobacter sakazakii、傷寒沙門氏菌Salmonella enteritidis、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、河流弧菌Vibrio fluvialis、創傷弧菌Vibrio vulnificus、哈氏弧菌Vibrio harveyi等。對蝦樣品從海口市周邊對蝦養殖場采集，包括45 份凡納濱對蝦、57 份斑節對蝦和42 份中國對蝦。

試驗主要試劑：Taq酶、dNTP 等試劑購自TaKaRa（大連）公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；感受態細胞DH5α、Pmd18-T-Simple Vector、限制性內切酶和T4 連接酶購自大連寶生物公司；3%APW 培養基、TCBS、營養瓊脂購于北京陸橋技術公司。試驗主要儀器：ABI ViiATM7 實時定量 PCR 儀、北京六一DYY－6C 型電泳儀、英國UVItec 公司凝膠成像系統。

1.2 試驗方法

1.2.1pirB基因特異性引物、探針設計 從GenBank 上獲得VpAHPND菌株pirB基因序列，應用Oligo6.0 軟件設計引物和探針。引物pirBF：5'-TTCATATTCACCTGCTGTTGG-3'，pirBR：5'-ACGATTTCGACGTTCCCCAA-3'；TaqMan 探針：5'-FAM-ACTATATTGCTACAGGTACGG AAGATGA-TAMRA-3'。引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 巢式PCR擴增 質粒AP4-1引物：F1：5'-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3'；R1：5'-ACGATTTCGACGTTCCCCAA-3'。質粒AP4-2引物：F2：5'-TTGAGAATACGGGACGTGG G-3'；R2：5'-GTTAGTCATGTGAGCACCTTC-3'。反應體系為：10×PCR buffer 2.0 μL，AP4-1上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL，TaqDNA聚合酶 1.0 μL，模板DNA 4 μL，加ddH2O補至25 μL。擴增程序為：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、71 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 4 min。取第一步的PCR產物，進行第二步nested-PCR。反應體系為：10×PCR buffer 3.0 μL，AP4-2上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，第一步PCR產物 4 μL，加ddH2O補至25 μL。擴增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、56℃30 s、72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 2 min。

1.2.3pirB基因標準質粒構建 根據pirB基因序列，設計特異性引物克隆pirB基因。采用 Primer 6.0引物設計軟件，設計帶酶切位點的特異性引 物，F：5'-CGGGATCCATGACTAACGAATACG TTGTAAC-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點），R：5'-CCGCTCGAGCTACTTTTCTGTACCAAATTC ATCG-3'（下劃線部分為XohⅠ酶切位點）。以提取的VpAHPND菌株 DNA 為模板，使用上述引物進行PCR 擴增，反應體系（25 μL）：2 ×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 5 min。將含有目的基因片段的PCR 產物和載體用BamH Ⅰ和XohⅠ酶切，T4 連接酶連接到pMD18-T 載體中制備重組質粒，轉化到感受態大腸埃希菌DH5α，涂在含有氨芐青霉素鈉的LB瓊脂平板上，挑單個獨立菌落接種至LB培養基中，搖床震蕩培養14 h。經質粒提取試劑盒回收、純化，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果正確的重組質粒作為陽性外參對照。質粒拷貝數按照公式計算：拷貝數（拷貝/μL）=質粒濃度（g/μL）× 6.02 × 1023/質粒分子量，質粒分子量=堿基對平均分子量（660）×重組質粒總長度（2692+1172），測得拷貝數為2.3×107拷貝/μL。

1.2.4pirB基因實時熒光PCR 反應條件優化以2.3×107拷貝/μL 標準品DNA 為模板，在56～65 ℃范圍內，以1 ℃梯度進行熒光定量PCR擴增，以獲得最低循環數（Ct）值和較高的相對熒光強度增加值（ΔRn）時的退火溫度。采用引物不同終濃度（0.1～0.6 μmol/L）與探針不同終濃度（0.10～0.50 μmol/L）組合進行熒光定量PCR，以獲得最低的Ct 值和較高的ΔRn 時的引物和探針濃度組合。反應體系補充ddH2O 至25 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 5 min。選取ΔRn 值最大且所用引物和探針濃度最小為反應體系。

1.2.5 熒光定量PCR 的特異性、靈敏度、重復性試驗 以VpAHPND菌株、單增李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌、阪崎腸桿菌、傷寒沙門氏菌、溶藻弧菌、河流弧菌、創傷弧菌、哈氏弧菌等病原體作為陰性對照菌株，并用ddH2O 作為無模板空白對照驗證熒光PCR 法檢測副溶血性弧菌pirB基因的特異性。

對已知拷貝數含有目的擴增片段的PMD18-pirB重組質粒進行10 倍梯度稀釋，以各梯度質粒為模板進行熒光PCR 檢測，確定該方法對靶基因的最低檢出限。

設計4 組樣品，分別取108、107、106、105濃度的VpAHPND菌株PMD18-pirB重組質粒進行PCR 試驗，每組4 次組內重復，測Ct 值求其平均值和標準差S，計算各組變異系數CV，以檢測的Ct 值變異系數（標準偏差/重復值的平均數）初步評估該方法的重復性。

1.3 對蝦樣品熒光RT-PCR 方法的應用

分別取3 種對蝦0.5 g 鰓和肝胰腺組織于1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL 滅菌生理鹽水后研磨勻漿，按照基因組DNA 快速提取試劑盒按說明書提取總DNA 作為模板。用建立的TaqMan 探針熒光定量PCR 進行檢測，同時采用世界動物衛生組織（OIE）推薦的套式PCR 法檢測樣品，檢測結果與熒光探針法進行比較。

2 結果與分析

2.1 克隆載體的構建

以VpAHPND菌株提取的DNA 為模板，經PCR獲得的目的片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得pirB基因的特異性條帶（1 172 bp，圖1）。回收純化擴增PCR 產物并與pMD18-T 克隆載體連接獲得重組克隆質粒pMD18-T-pirB，目的基因和重組克隆質粒同時用BamH Ⅰ和XohⅠ進行酶切、T4 連接酶連接后轉化到感受態細胞DH5α中進行擴增，篩選陽性克隆子pMD18-T-pirB，并對陽性克隆載體進行雙酶切驗證，經BamH Ⅰ/XohⅠ雙酶切鑒定，有一條大小約1 200 bp的片段，與目的片段大小一致，另一條大小約2 600 bp 的載體片段，與克隆載體pMD18-T 大小一致（圖2）。

圖1 pirB 基因擴增產物Fig.1 PCR amplification products of pirB gene

圖2 pMD18-T-pirB 質粒酶切鑒定Fig.2 Identification of pMD18-T-pirB plasmid

2.2 熒光定量PCR 反應條件的優化

引物和探針濃度篩選試驗結果表明，采用0.5 μmol/L 引物和0.2 μmol/L 探針進行檢測，獲得的Ct 值最小且熒光增加值較大，因此確定引物和探針的最佳濃度分別為0.5、0.2 μmol/L。對熒光定量PCR 反應體系中其余各組分濃度進行優化，最終確定優化后的副溶血性弧菌pirB熒光PCR 反應體系（25 μL）為：Probe qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，探針1.0 μL，模板2 μL，用滅菌ddH2O 補足至25 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 5 min。在每次延伸結束時收集熒光信號。

2.3 熒光定量PCR 特異性分析

用所建立的RT-PCR 檢測方法對VpAHPND菌株、單增李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、大腸埃希氏菌、阪崎腸桿菌、傷寒沙門氏菌、溶藻弧菌、河流弧菌、創傷弧菌、哈氏弧菌等病原菌進行檢測，結果顯示只有VpAHPND菌株出現典型的擴增曲線，而其他對照菌株和空白對照均未出現擴增曲線。說明建立的熒光定量PCR 法對VpAHPND的檢測具有很強的特異性（圖3）。

圖3 TaqMan PCR 方法特異性分析Fig.3 Specific analysis of TaqMan PCR method

2.4 pMD18-T-pirB 質粒RT-PCR 靈敏度分析

用ddH2O將2.3×107拷貝/μL的pMD18-TpirB質粒作10倍系列稀釋，取各個稀釋度作熒光PCR檢測確定其最低檢出限，結果顯示在pMD18-T-pirB質粒拷貝數為2.3×101時，Ct值為34.27，表明該檢測方法至少能檢測到2.3個質粒拷貝數（圖4）。為保證檢測結果的準確性，在實際檢測中以 Ct值 35為界限，若檢測樣品的Ct值≤35，且有擴增曲線，則判為VpAHPND陽性；Ct值＞35，且有擴增曲線，則重復1次，如結果一致判為VpAHPND陽性；Ct 值＞35，重復結果未出現擴增曲線，判為VpAHPND陰性。

圖4 TaqMan PCR 方法靈敏性分析Fig.4 Sensitivity analysis of TaqMan PCR method

2.5 pMD18-T-pirB 質粒RT-PCR 重復性分析

對樣品進行組間重復性試驗，組內重復性分析分別選取108、107、106、105/μL 濃度的pMD18-T-pirB質粒，按照程序進行PCR 試驗，結果見圖5。根據4 次組內重復計算其平均值和標準差，變異系數CV介于0.45 %～0.69 %之間（表1），組內重復性良好，穩定性強。

圖5 熒光定量PCR 組間重復試驗分析Fig.5 Intra repeatability test analysis of real-time PCR

表1 熒光定量PCR 組間重復試驗分析Table 1 Intra repeatability test analysis of real-time PCR

2.6 熒光定量PCR 方法的應用

應用建立的RT-PCR 方法對采集的45 份凡納濱對蝦、57 份斑節對蝦和42 份中國對蝦樣品進行VpAHPND檢測，分別檢出陽性樣品19、7、6 份，陽性率分別為24.4%、12.3%、14.2%。檢測結果與OIE 推薦的套式PCR 法檢測結果一致，說明該方法檢測實際樣本具有較高可靠性。

3 討論

通過基因組測序發現，一些非副溶血性弧菌屬的AHPND 致病原被確定攜帶PVA1 質粒，如哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、歐文斯氏弧菌（Vibrio owensii）和坎貝氏弧菌（Vibrio campbellii）［14-15］，說明這些毒力基因能夠被傳播到不同的弧菌種類中，并且質粒基因的結構表明pirA和pirB基因的缺失或獲得可通過水平基因轉移的轉位或同源重組而發生流動，因此AHPND 可能不僅可由副溶血弧菌引起，也能由攜帶 PVA1 質粒的其他弧菌屬引起［16］，因此根據PVA1 質粒設計特異性引物和探針減少了檢測結果出現假陰性的概率。

試驗取病蝦肝胰腺組織在3%APW 培養肉湯中增菌后，提取DNA 后擴增不出陽性條帶，而直接取病蝦肝胰腺組織提取DNA 后，能夠擴增出陽性條帶。副溶血弧菌廣泛存在于環境中，推測可能是樣品中的其他副溶血弧菌在增菌過程中逐漸取代了VpAHPND菌株成為優勢菌株，致使毒素基因很難再被檢測到［17］。本試驗在對病蝦臨床樣品的VpAHPND檢測時選擇直接對肝胰腺組織提取DNA 作為模板。對本試驗擴增的所有陽性片段經過測序，所得序列有98.7%同源性，因此這些菌株可能都起源于一個單一克隆。應用建立的RTPCR 方法對采集的45 份凡納濱對蝦、57 份斑節對蝦和42 份中國對蝦樣品進行VpAHPND檢測，檢出陽性樣品32 份，檢測結果與OIE 推薦的套式PCR 法檢測結果一致。

開展AHPND 診斷，最精確的采樣部位是腸道等器官［18］，但發病前鰓可能有更靈敏的病原菌檢出，發病高死亡率期間，肝胰腺是最靈敏的可檢測組織，而在發病后期，除了肝胰腺和腸道外，也可選擇肌肉組織作為樣本［19］。本試驗針對蝦鰓、肝胰腺、腸胃等不同部位取樣進行檢測，鑒別在水體傳播AHPND 過程中不同部位的感染過程。

AHPND 的常規PCR 檢測方法是以pirA毒力基因為靶基因來檢測VpAHPND，通過檢測pirA毒力基因拷貝數實現對VpAHPND的定量檢測［20］，從而分析病原菌的侵染途徑，但pirA毒力基因的分子檢測結果陽性強度低，本試驗以pirB毒力基因為靶基因建立實時熒光PCR 方法，結果表明該方法能有效檢測VpAHPND。

4 結論

本試驗針對對蝦急性肝胰腺壞死病病原菌副溶血性弧菌建立了PCR 擴增方法，根據其質粒保守序列設計了特異性引物及探針，優化了PCR 反應的退火溫度、引物及探針濃度等參數，能夠有效檢測目標基因。當pirB基因標準質粒濃度范圍為 2.3×101～2.3×107拷貝/μL 時，標準曲線具有良好的線性關系。該方法靈敏度高，最低檢測限為2.3 拷貝/μL；特異性強，與對蝦其他病原菌無交叉反應；重復性好，重復試驗變異系數為0.45%～0.69%。可在1 h 內完成對蝦樣品的實時熒光定量檢測，臨床檢測結果與世界動物衛生組織推薦的套式PCR 法檢測結果一致，可用于臨床對蝦樣品的VpAHPND檢測。及早檢測和診斷水產動物是否感染急性肝胰腺壞死病并采取相應措施防止該病菌擴散，有利于水產養殖疾病的提前預警，是水產養殖減少損失的有效途徑。