FOXO 基因對印楝素誘導sf9 細胞凋亡的影響

邵雪花，賴 多，匡石滋

（廣東省農業科學院果樹研究所/農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】印楝素（azadirachtin,AZA）作為植物源殺蟲劑的典型代表，可抑制多種害蟲的生長發育，已被廣泛應用到害蟲防制中［1］。草地貪夜蛾是農業生產中的重要害蟲［2］，也是對印楝素最為敏感的害蟲之一。研究表明，對FOXO基因是調控昆蟲生長發育的關鍵轉錄因子［3］，但該基因如何調控印楝素所誘導的昆蟲細胞凋亡卻未見報道，這在一定程度上制約了印楝素的科學使用。【前人研究進展】印楝素是從印楝樹（Azadirachta indicaA.Juss）的種子、葉子和其他部分中分離出來的檸檬苦素類化合物，幾十年來一直在害蟲綜合治理中用作拒食劑和害蟲生長調節劑［4］。AZA 被認為是最有效生物農藥之一，最適合于商品化開發的植物源殺蟲劑［5-7］。草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是起源于美洲大陸的一種跨國界遷飛性農業重大害蟲，具有繁殖能力強、遷飛擴散快和防控難度大等特點［8-10］。其寄主范圍廣，幼蟲可取食禾本科、菊科、豆科和莧菜科等76 科353 種植物，給生產帶來巨大威脅［11］。前人研究表明，AZA 可以誘導粉紋夜蛾（Cabbage looperHi-5）、斜紋夜蛾（Spodoptera lituraSL-1）和 草地貪夜蛾（Spdoptera frugiperdasf9）等多種昆蟲細胞凋亡，進而抑制細胞增殖［12-14］。此外，AZA 已被證明可激活癌細胞中的多種凋亡信號通路，如受體通路、AIF 介導通路、ROS 依賴性、p38 和JNK1/2 通路以及MAPK通路［15-16］。細胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細胞死亡（Programmed cell death，PCD），是一種特殊的細胞死亡方式，是為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程［17］。當細胞凋亡調控失衡時，可引起細胞過度增殖或過度凋亡，導致細胞死亡和相關疾病的發生［18］。FOXO基因作用廣泛，參與調控生長、抗腫瘤、細胞分化、新陳代謝及細胞凋亡等多種過程［19］。FOXO 不僅可調控幼蟲的生長發育，還能通過胰島素受體InR對胰島素信號通路進行反饋調節［20］。【本研究切入點】我們之前的研究表明AZA 可通過溶酶體釋放組織蛋白酶而誘導中腸細胞凋亡［21］，FOXO基因位于溶酶體信號通路的上游，可參與調控凋亡信號的轉導通路，那么該基因是如何調控印楝素誘導的昆蟲細胞凋亡呢？本研究從轉錄因子FOXO出發，結合細胞生物學、分子生物學等技術手段，研究FOXO基因在印楝素誘導sf9 細胞凋亡中的作用。【擬解決的關鍵問題】本研究以印楝素和草地貪夜蛾卵巢細胞為研究對象，探討印楝素通過FOXO轉錄因子調控sf9 細胞的增殖和凋亡的作用機理，為探索印楝素分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藥物及試劑：草地貪夜蛾卵巢細胞sf9（C0004）購自于深圳市百恩生物科技有限公司，印楝素（A115081）購于上海晶純生化科技股份有限公司，SFM（12682-019）購于賽默飛世爾科技公司，小牛血清（11011-8611）購自于杭州四季青生物工程材料有限公司，Phospho-FOXO（#84192）、Cleaved Caspase-3（#9661）、Bim（#2933）均購自Cell signaling 公司，小鼠單克隆抗體，HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（D110087）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，HRP 標記羊抗兔IgG（#A0208）購自碧云天生物技術有限公司，ECL 顯色試劑盒（#1705060）購自Bio-Rad 公司，BCA 定量試劑盒（#PA115）購自于天根生化科技（北京）有限公司。

細胞培養：將復蘇后穩定生長的sf9 細胞置于培養基中，加入含有10%小牛血清的SFX，在27 ℃細胞培養箱中孵育，傳代至對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2 CCK-8 法檢測細胞增殖

將傳代至對數生長期的sf9 細胞懸浮液（100～500 CFU/μL）接種到96 孔板（100 μL/孔）中。待細胞貼壁后，吸棄培養基，加入不同濃度的AZA 培養液，設置AZA 0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20、40、80 mmol/L 8 個濃度處理，另設細胞對照和溶劑對照（1‰ DMSO），27 ℃孵育48 h，向各孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育3 h，于450 nm 處測定吸光度。每個濃度設置8 個重復孔，并取每組中3 次實驗的平均值，計算細胞活力:

式中，A加藥為含有細胞、CCK-8 和AZA 的孔內OD 值，A空白為只含CCK-8、不含細胞和AZA 的孔內OD 值，A零加藥為含細胞、CCK-8 不含AZA的孔內OD 值。

1.3 透射電鏡觀察sf9 細胞

5 mmol/L AZA 分別作用于細胞24、48、72 h，對照加入1‰ DMSO 細胞培養液，每隔2 d 重新更換培養液并重新給藥。反復吹打后收集細胞懸浮液，室溫800 r/ min 離心5 min，棄去上清液。用 PBS 溶液（pH7.4）洗滌3 次，800 r/ min 離心5 min 后用2.5%戊二醛吹散并置于4 ℃過夜。第2 天室溫800 r/ min 離心5 min，收集細胞沉淀，用PBS 溶液（pH7.4）洗滌3 次，800 r/ min 離心5 min。使用2%瓊脂粉包埋細胞沉淀，修切包埋塊后用PBS 清洗3 次，800 r/ min 離心5 min。用1%鋨酸固定2 h，每次PBS 洗滌3 次，每次洗滌30 min；用不同濃度梯度的乙醇進行脫水處理，每次脫水20 min。脫水后的樣品用樹脂與丙酮滲透4 h，然后在純樹脂中滲透過夜；將樣品在聚合反應器中聚合，重新包埋后用LKB-V 超薄切片進行切片，后將超薄切片用乙酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色，自然干燥后在透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 流式細胞儀分揀Annexin V-FITC/PI 染色的凋亡細胞

將sf9 細胞鋪滿6 孔板的90 %，用AZA 處理細胞處理方式同透射電鏡檢測；使用細胞刮刀輕輕刮取細胞，800 r/min 離心5 min 收集細胞沉淀；用預冷的PBS 洗滌細胞沉淀2 次，800 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清。使用500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞，用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混勻后輕輕吹打細胞后避光，室溫反應10 min。最后使用流式細胞儀檢測Annexin V-FITC的綠色熒光和PI 的紅色熒光。

1.5 Western blot 檢測蛋白表達

5 mmol/L AZA 處理sf9 細胞48 h 后，對照加入1‰ DMSO 的細胞培養液，用PBS 洗滌3 次，用RIPA 提取總細胞蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量，加入4×蛋白質上樣緩沖液。煮沸5 min，分裝后于-20 ℃冰箱保存待用。將約20 μg 蛋白質進行SDS-PAGE 電泳，并將蛋白質轉移至PVDF 膜。將10%脫脂奶粉封閉2 h 后，將一抗于4 ℃搖床上孵育過夜，用PBS 洗滌膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，并用ECL 發光試劑盒測試。使用Image Pro4.5 圖像分析軟件進行灰度掃描，分析每個條帶的灰度值，以β-Tubulin作為內部參考。分別以Phospho-FOXO、Cleaved Caspase-3、Bim 和β-Tubulin 進行灰度比值計算作半定量分析。

1.6 RNA 提取和qRT-PCR

用TRIzol試劑提取sf9細胞的總RNA，通過試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green Master MixqPCR定量試劑盒測定FOXO和α-tubulin的m R N A 表達水平。引物序列如下：F O X O（F:5'-GGATGTGCATTCTATGGTGTACC -3';R:5'-TTTCGGGATTGCTTTATCTCAGAC -3'）,α-tubulin（F:5'-CGCATTCATGGTTGATAACG-3';R:5'-GGGCACCAAGTTAGTCTGGA -3'），基因相對表達量采用2-ΔΔCt法測定［22］，重復3次。

1.7 雙鏈RNA 合成及Caspase-3 酶活檢測

通 過T7 RNAi 系 統（RiboMAXTM）合 成dsRNAFOXO，用 LipofectamineTM2000 轉 染 sf9細胞。轉染 dsRNAFOXO后，收集 AZA 處理的sf9 細胞利用Caspase-3 酶活檢測試劑盒測定其活性。800 r/min 離心5 min 收集細胞，PBS 洗滌細胞3 次，加入RIPA 裂解緩沖液提取細胞總蛋白。隨后使用 BCA 試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白溶液與Caspase-3 的特異性發光底物在37 ℃避光孵育4 h，在405 nm 處測定光密度。

試驗數據使用SPSS 19.0 單因素方差分析（SPSS，Chicago，USA）進行差異顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 印楝素抑制sf9 細胞增殖

CCK-8 法檢測結果表明，AZA 在體外對草地貪夜蛾卵巢細胞的增殖有明顯的抑制作用。作用48 h 后，細胞活力隨AZA 濃度的增加而顯著降低（圖1A），呈明顯的濃度依賴性。當AZA 在較低濃度0.625 mmol/L 時，細胞活力為95.32%；當AZA 處理濃度為5 mmol/L 時，細胞存活率為67.31%，將該濃度用作后續試驗的處理濃度。進一步用5 mmol/L 的AZA 處 理sf9 細胞24、48、72、96 h 后發現，細胞活力隨處理時間的延長而呈下降趨勢（圖1B）。由此可見，AZA 對sf9 細胞的抑制作用呈明顯的時間和濃度依賴性。

2.2 印楝素破壞sf9 細胞的微觀結構

用5 mmol/L AZA 分別處理sf9 細胞0、24、48、72 h，從結果（圖2）可以看出，AZA 處理0 h 細胞結構完整，細胞核較大核膜清晰可見，染色質分布均勻，可見明顯的細胞器。當AZA 處理24 h 后，細胞核收縮，染色質聚集，細胞質呈空泡狀；處理48 h 后，細胞空泡化增加，細胞膜收縮，染色質聚集更嚴重，細胞變形;處理72 h 后，細胞核的染色質聚集成大顆粒并沿核膜分布，細胞骨架破損，細胞變形不能維持正常的穩態，細胞崩解逐級走向死亡。表明印楝素可破壞草地貪夜蛾卵巢細胞的超微結構。

2.3 印楝素誘導sf9 細胞凋亡

根據Annexin V-FITC/ PI 聯用的流式細胞分揀原理，其檢測能夠將樣本中的正常細胞（圖3A左下）、死亡細胞（圖3A 左上），早期凋亡細胞（圖3A 右上）和中晚期凋亡細胞（圖3A 右下）分類和統計，獲得的結果可以更好地計算細胞凋亡率。根據統計結果（圖3B），可看出隨AZA 處理時間延長，早期凋亡細胞比率增加。處理0 h為1.09%，處理24 h 為14.83%，處理48 h 為23.81%，處理72 h 為46.94%，不同處理間差異顯著，即AZA 誘導的sf9 細胞凋亡率與時間呈正相關。

2.4 印楝素通過上調FOXO 基因誘導sf9 細胞凋亡

用5 mmol/L AZA 處理sf9 細胞48 h 后，與對照相比凋亡蛋白Bim 和Cleaved-Caspase-3 的表達水平顯著增加（圖4A、B）。FOXO 總蛋白表達無明顯差異，但P-FOXO 蛋白表達顯著低于對照。表明AZA 可抑制sf9 細胞中FOXO 蛋白的磷酸化水平，從而誘導凋亡。進一步利用qRT-PCR 檢測發現，FOXO基因的表達量與AZA 處理時間呈正相關，在此基礎上通過RNAi 技術降低FOXO基因在sf9 細胞中的表達量，經AZA 處理后發現Caspase-3 的酶活性顯著降低。表明AZA 可通過上調轉錄因子FOXO的表達而誘導sf9 細胞凋亡。

3 討論

印楝素是目前世界公認的活性最強的拒食劑和昆蟲生長調節劑，是最優秀的生物農藥之一。印楝素處理后，昆蟲不能正常蛻皮，停滯在幼蟲-蛹中間體或永久幼蟲狀態［13］。大量實驗證明，印楝素可導致草地貪夜蛾、斜紋夜蛾和粉紋夜蛾等昆蟲離體細胞的線粒體膜電位降低，引起細胞凋亡［23-24］。早在1993 年，Rembold 和Annadurai曾報道印楝素可影響草地貪夜蛾卵巢細胞sf9 的增殖和蛋白合成［25］。本研究采用CCK-8 方法證實了AZA 可抑制草地貪夜蛾卵巢細胞的增殖，且呈現時間和濃度的依賴性。透射電鏡發現sf9 細胞的微觀結構發生明顯變化，即細胞核發生變形和皺縮，染色質聚集，細胞質空泡化；流式細胞凋亡率檢測表明，凋亡細胞與處理時間呈正相關，提示AZA 抑制sf9 細胞增殖，促進細胞凋亡，與前期研究結果一致。

細胞凋亡受細胞內各種分子調節，FOXO 屬于叉頭轉錄因子家族，在細胞凋亡中起重要作用［26］，可被PI3K/Akt 信號通路調控，該通路與細胞生存密切相關。FOXO 為Akt 的下游底物，激 活Akt 使FOXO 的Thr32、Ser253 及Ser315 三個位點發生磷酸化，并從細胞核轉運至細胞質，不發揮其轉錄因子的作用；反之，當Akt 的活性下降時，FOXO 的磷酸化水平下降，非磷酸化的FOXO 可移位進入細胞核，發揮其轉錄活性，誘導靶基因的轉錄［27］。Bim 蛋白是Bcl-2 凋亡相關蛋白家族中僅含有BH3 結構域的促凋亡蛋白，是FOXO 誘導的重要靶基因，轉錄因子FOXO 可結合于Bim 的啟動子上調控Bim 的表達。Bim 表達上調促進線粒體釋放細胞色素c 及Caspase 的激活，從而導致細胞凋亡［28-29］。本研究顯示，AZA 作用sf9 細胞后，FOXO 總蛋白水平沒有顯著變化，但磷酸化水平降低，靶基因Bim 的蛋白表達量增加，Cleaved Caspase-3 蛋白的表達水平上升，說明印楝素通過降低sf9 細胞中FOXO基因的磷酸化水平，使其發揮其轉錄因子活性，進而誘導FOXO 的靶基因促凋亡蛋白Bim 表達量升高，該蛋白表達量升高導致Caspase-3 的激活。為驗證這一結論，本研究在此基礎上，利用RNAi技術降低sf9 細胞中FOXO基因表達，AZA 處理后發現Caspase-3 活性顯著降低，證實轉錄因子FOXO可調控AZA 誘導的sf9 細胞凋亡。然而，由AZA 控制的細胞的凋亡過程非常復雜，涉及多個信號通路和生物過程，其分子機制仍需進一步研究。

4 結論

本研究以草地貪夜蛾卵巢細胞sf9 為研究對象，探討了印楝素對sf9 細胞增殖的影響及其作用機理。結果表明，印楝素對sf9 細胞有明顯的增殖抑制作用，且呈明顯的時間和濃度依賴性。透射電鏡觀察到5 mmol/L AZA 可破壞sf9 細胞的微觀結構，導致細胞核收縮，染色質聚集，細胞質空泡狀；進一步通過流式細胞儀檢測發現，AZA 可誘導sf9 細胞凋亡并與處理時間呈正相關；分子生物學實驗發現AZA 可使sf9 細胞中FOXO 蛋白的磷酸化水平降低，靶基因促凋亡Bim 和Cleaved Caspase-3 的表達量增加；進一步利用RNAi 技術沉默FOXO后，經AZA 處理發現Caspase-3 的酶活性顯著降低。表明印楝素可通過上調FOXO的表達而誘導草地貪夜蛾卵巢細胞凋亡。