超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中5種硝基咪唑殘留量

薛慶海

無錫市食品安全檢驗檢測中心 (無錫 214028)

硝基咪唑類藥物(nitroimidazoles，NMZs)是一類具有硝基咪唑環結構的化合物，被廣泛用于治療動物的厭氧細菌和寄生蟲感染，同時也是一種生長促進劑，能夠促進禽畜的生長及改善飼料轉換率[1,2]。研究表明該類化合物具有潛在的細胞誘變性、致畸致癌性等危害，且在體內轉化的代謝產物仍具有毒理作用[3-5]，因此已被美國和歐盟等發達國家禁用。我國也對硝基咪唑類獸藥進行了嚴格限制，GB 31650—2019[6]僅允許甲硝唑、地美硝唑作為治療用，但不得在動物性食品中檢出。

目前，硝基咪唑類藥物的檢測方法有酶聯免疫吸附法[7]、液相色譜法[8,9]、氣相色譜-串聯質譜法[10]、液相色譜-串聯質譜法[2-4,11-14]。酶聯免疫吸附法檢測成本較低，適用于批量快速篩查，但容易出現假陽性、假陰性；液相色譜法的靈敏度較低，容易被雜質干擾，無法準確定性；氣相色譜-串聯質譜法，樣品前處理需要衍生化，所需時間長，操作較復雜；液相色譜-串聯質譜法的靈敏度高、選擇性好，目前在硝基咪唑類的檢測中廣泛應用，相關國家標準[15-17]也采用了液相色譜-串聯質譜法。GB/T 21318—2007、SN/T 1928—2007標準前處理步驟較多，而且用到GPC凈化，試劑消耗多且不能批量前處理；SN/T 2624—2010標準不僅適用于硝基咪唑類的檢測，還適用于磺胺類、三苯甲烷類等多種堿性藥物殘留的檢測，所以前處理相對復雜。本研究建立了一種QuEChERS提取凈化、C18固相萃取柱進一步凈化，UPLC- MS/MS法檢測豬肉中5種硝基咪唑殘留量的方法。該方法前處理簡單、回收率高、精密度高，可用于豬肉中5種硝基咪唑殘留量的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品，購于無錫市各超市；甲硝唑(Metronidazole，MNZ)、洛硝噠唑(Ronidazole，RNZ)、地美硝唑(Dimetridazole，DMZ)、羥基甲硝唑(MNZOH)、羥甲基甲硝咪唑(HMMNI)標準品(純度大于99.5%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸，色譜純，德國默克公司；微孔濾膜(有機系)，0.22 μm，上海安譜；QuEChERS萃取鹽包(含4 g無水硫酸鈉、1 g氯化鈉)，美國安捷倫公司、C18固相萃取柱(1.0 g，6 mL)，美國安捷倫公司。

1.2 儀器與設備

QTRAP 4500型超高效液相-串聯四級桿質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)，美國SCIEX公司；C18色譜柱，美國安捷倫公司；Vortex 3型渦旋振蕩器，德國IKA公司；Milli-Q IQ7000型超純水系統，德國默克公司；超聲波清洗機，寧波新芝公司；X1R型高速冷凍離心機，美國賽默飛公司；固相萃取裝置，上海安譜公司；AutoEVA-20Pus型氮吹儀，廈門睿科公司；ME204E型分析天平，瑞士梅特勒公司；XS205DU型分析天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 實驗方法

1.3.1溶液配制

0.1%甲酸水溶液：吸取1.0 mL甲酸，加超純水混勻并定容至1 000 mL。

標準溶液配制：準確稱取10 mg(精確至0.1 mg) 每種標準物質，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，標準儲備液的濃度為1 mg/mL，貯存于棕色標液瓶中，-20 ℃冰箱中保存。分別吸取每種標準儲備液1.0 mL，用甲醇稀釋并定容至100 mL，得到10 μg/mL的混合標準中間溶液，貯存于棕色標液瓶中，0 ℃～4 ℃冰箱中保存。使用時根據需要用空白基質溶液稀釋成適當濃度的空白基質混合標準溶液，現用現配。

1.3.2樣品前處理

稱取5.0 g(精確至0.01g)經攪碎、混勻的樣品至50 mL離心管中，加入3 mL水，渦旋混勻，加入10 mL乙腈和QuEChERS萃取鹽包，渦旋振蕩10 min；在4 ℃下以10 000 r/min的轉速下低溫離心10 min，轉移上清液至另一離心管中，待進一步凈化；將上清液全部傾入用5 mL甲醇預淋洗過的C18固相萃取柱中，以1 mL/min的速度收集流出液，再用10 mL甲醇進行洗脫，收集全部洗脫液于試管中，用氮吹儀在40 ℃條件下吹至近干，殘渣用初始流動相溶解并定容至1 mL，經0.22 μm有機相濾膜過濾，待測。

1.3.3.1 超高效液相色譜條件

色譜柱，Agilent ZORBAX XDB-C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；柱溫30 ℃；流動相，A為0.1%甲酸水，B為甲醇；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL。

梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1～3 min，5%～95%B；3～4 min，95%B；4～4.2 min，95%～5%B；4.2～6 min，5%B。

1.3.3.2 質譜條件

離子源，電噴霧離子源(ESI)；掃描方式，正離子掃描；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；輔助氣壓力35 psi；離子源溫度550 ℃；碰撞氣為氮氣；檢測方式，多反應監測(MRM)。其他參數見表1。

表1 5種硝基咪唑的質譜參數

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

考慮到乙腈對大多數獸藥殘留的提取效果較好、通過鹽析較容易實現與水相的分離[18]，因此選用乙腈作為硝基咪唑類藥物的提取劑。豬肉樣品(加標1.0 μg/kg)中的硝基咪唑類藥物經過乙腈提取，QuEChERS萃取鹽包凈化后，經過UPLC-MSMS分析，發現基質干擾比較大，考慮使用固相萃取柱進一步凈化。選用了C18、MCX、SCX 3種固相萃取柱對QuEChERS提取液凈化，發現凈化后，硝基咪唑類藥物的回收率均在85%以上，回收效果良好。考慮到使用C18固相萃取柱凈化只需要用到甲醇一種溶劑，而MCX、SCX柱則要使用多種溶液，所以選用C18柱進行凈化。

2.2 定溶液的優化

在實驗中發現，采用甲醇直接定容進樣，多個化合物產生溶劑效應，色譜峰寬大畸形，甚至分叉；而采用初始流動相0.1%甲酸-甲醇(95∶5，v/v)定容時，可獲得尖銳對稱的色譜峰，并且化合物靈敏度較高。所以，選擇初始流動相0.1%甲酸-甲醇(95∶5，v/v)定容。

2.3 質譜條件的優化

將5種硝基咪唑類混合標準中間溶液用空白基質溶液稀釋成1 μg/mL的空白基質標準混合溶液，使用針泵進樣，直接進質譜。在正離子模式下進行一級質譜全掃描，確定各硝基咪唑類的分子離子，將分子離子作為母離子；給予一定的碰撞能量對母離子進行二級質譜掃描，進一步對碰撞能量和去簇電壓等參數進行優化，選取響應高且干擾小的兩個子離子作為定量定性離子，響應最高的作為定量離子，優化結果見表1。

2.4 線性范圍、回歸方程和定量限

在選定的液相色譜-串聯質譜條件下，5種硝基咪唑類藥物出峰良好，其典型的MRM譜圖見圖1。

圖1 5種硝基咪唑標準溶液的典型MRM圖

稱取6份空白樣品，按照1.3.2的前處理方法處理， 得到空白基質溶液，配制濃度為1、10、50、100、200、500 μg/L的空白基質混合標準溶液，分別進行測定。以待測物定量離子的峰面積y對其濃度x(μg/L)得到5種硝基咪唑的線性回歸方程，其線性方程及相關系數見表2。以信噪比為10(S/N=10)計算5種硝基咪唑的定量限，見表2。

表2 5種硝基咪唑的回歸方程、線性范圍、相關系數、定量限

2.5 方法回收率和精密度

MNZOH在0.6、1.2、6.0 μg/kg 3個水平，其余4種硝基咪唑分別在0.5、1.0、5.0 μg/kg 3個水平進行加標回收實驗，每個水平設置6個平行樣，并計算其加標回收率，結果如表2所示。結果表明：在豬肉樣品中，5種硝基咪唑的平均加標回收率在79.6%～103.2%之間，各平行樣間的相對標準偏差在2.1%～9.1%之間，平行性較好。

表2 5種硝基咪唑的回收率及精密度

2.6 實際樣品的測定

采用本方法對無錫市各超市采購的20批次豬肉(前腿肉、后腿肉等)樣品進行測定，結果均為未檢出，說明生豬養殖企業能夠較好的執行相關國家規定，嚴格控制硝基咪唑類藥物的使用。

3 結論

本研究建立了乙腈提取、QuEChERS凈化、C18固相萃取柱進一步凈化，UPLC-MSMS法測定豬肉中5種硝基咪唑殘留量的方法。該方法前處理簡單、快捷，回收率高，重復性好，靈敏度高，適合豬肉中5種硝基咪唑殘留量的檢測。