QuEChERS前處理HPLC柱后衍生法測定大米粉中克百威含量的研究

夏 輝，劉 旭，蔣國振，劉 萍,趙 荔

陜西省糧食質(zhì)量安全中心 (西安 710016)

克百威是一種農(nóng)業(yè)種植中使用的廣譜殺蟲劑。可用于防治土壤內(nèi)及地面上的300多種害蟲和線蟲。克百威對膽堿酯酶抑制的不可逆性決定了其對人、畜、禽等的毒性極高[1]。雖然國家已經(jīng)禁止使用克百威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥，但作為高效廣譜殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用仍較廣泛，其在糧食中的殘留對健康和環(huán)境造成嚴(yán)重危害。

目前，報(bào)道的關(guān)于測定克百威殘留量的方法主要有氣相色譜法[2]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[3-5]。但采用QuEChERS專用鹽包前處理技術(shù)，HPLC柱后衍生法測定大米粉中克百威含量的方法鮮有報(bào)道。用QuEChERS專用鹽包前處理技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種比較新的色譜前處理技術(shù)。該前處理方法具有方便、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。一般情況下樣品前處理只需要幾分鐘即可完成，大大縮短了前處理試驗(yàn)所需的時(shí)間。處理后的樣品完全可以滿足色譜、質(zhì)譜等試驗(yàn)的要求。

本研究方法采用QuEChERS專用鹽包前處理，HPLC柱后衍生法測定大米粉中克百威的含量，建立的方法方便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為保障糧食質(zhì)量安全提供了可靠的方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、FLR檢測器和柱后衍生系統(tǒng)，美國Waters公司；AE200型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；超純水機(jī)，美國Milipore公司。

1.2 主要試劑

克百威標(biāo)準(zhǔn)品，濃度100 μg/mL，含量99.8%，中國食品藥品檢定研究院；甲醇，色譜純，德國Merck公司；乙腈，色譜純，德國Merck公司；QuEChERS專用鹽包，美國安捷倫公司；SPE凈化柱(Florisil-SPE 1 g/6 mL；LC-NH2-SPE 500 mg/6 mL；C181 g/6 mL)；磷酸，優(yōu)級純；超純水。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

移取1.0 mL克百威標(biāo)準(zhǔn)樣品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制備成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；再逐級用甲醇稀釋制備成1.0 μg/mL、0.5 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、0.01 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

自動(dòng)進(jìn)樣器吸取2 μL克百威標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，熒光檢測器在激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長465 nm下記錄克百威峰面積，以克百威峰面積為縱坐標(biāo)，以克百威濃度為橫坐標(biāo)，繪制克百威標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3樣品前處理

準(zhǔn)確稱取大米粉樣品(粉碎后過40目篩)10 g(精確至0.01 g)于250 mL具塞三角瓶中。加入30 mL蒸餾水，靜置30 min，再加入30 mL乙腈，用振蕩器200 r/min振蕩提取30 min，提取液過濾至裝有QuEChERS專用鹽包的離心管中，內(nèi)含1 200 mg無水硫酸鎂、400 mg PSA和400 mg C18，渦旋1 min后，4 000 r/min離心5 min后，吸取5 mL上清液于10 mL離心管中，在50 ℃水浴中氮吹蒸發(fā)近干，加入2 mL甲醇溶解殘余物，渦旋混勻，待凈化。

將固相萃取柱用4 mL甲醇-二氯甲烷溶液預(yù)淋洗，當(dāng)液面到達(dá)柱篩板頂部時(shí)，立即加入上述待凈化溶液，用10 mL離心管收集洗脫液，用2 mL甲醇-二氯甲烷溶液涮洗燒杯后過柱，并重復(fù)1次，收集洗脫液于50 ℃水浴中氮吹蒸發(fā)近干，加入2.5 mL甲醇溶解殘余物，渦旋混勻，微孔濾膜過濾，待測。

1.3.4樣品測定

自動(dòng)進(jìn)樣器吸取2 μL樣品測試液注入液相色譜儀，熒光檢測器在激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長465 nm下記錄克百威峰面積，根據(jù)樣品測試液的克百威峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算出克百威的濃度。

1.3.5計(jì)算結(jié)果

試樣中克百威含量計(jì)算公式如下：

X=C×V×N/m

式中：X為試樣中克百威含量，mg/kg；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的待測液中克百威的濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；N為樣品定容后的稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

1.3.6儀器條件

色譜柱：C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,4 μm)；流動(dòng)相，甲醇:水溶液，梯度洗脫；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL；熒光檢測器，激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長465 nm。

1.3.7柱后衍生條件

柱后反應(yīng)單元的溫度，80 ℃；水解溫度，100 ℃；衍生溫度，室溫。柱后衍生低壓限：0 psi；0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，流速0.3 mL/min；OPA試劑，流速0.3 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性結(jié)果

以克百威的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到克百威標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。克百威的線性回歸方程(n=5)為：Y=2.83e+005X+4.50e+003(R2=0.999 6)。結(jié)果表明：克百威在0.01～1.00 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 克百威標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢出限和定量限

圖2為克百威檢出限色譜圖。取標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度0.01 μg/mL的克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇不斷稀釋，當(dāng)信噪比為3時(shí)，克百威的檢出限為0.002 mg/kg；當(dāng)信噪比為10時(shí)，克百威的檢出限為0.006 mg/kg。

圖2 克百威檢出限色譜圖

2.3 精密度

圖3為克百威色譜圖。取濃度為0.1 μg/mL的克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。色譜峰面積結(jié)果見表1。由表1可知，測得克百威峰面積的RSD為 0.12%，結(jié)果表明，此方法精密度較好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

圖3 克百威(0.1 μg/mL)精密度試驗(yàn)色譜圖

2.4 重復(fù)性

取不同加標(biāo)濃度的樣品6份，每份樣品稱取兩個(gè)平行樣，按1.3.3前處理后，按液相色譜條件做重復(fù)性試驗(yàn)，記錄色譜圖，計(jì)算克百威的含量。

由表2可知，樣品中克百威的重復(fù)性為3.5%～8.3%。結(jié)果表明，樣品重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收率

稱取空白樣品9份，每份10 g(精確至0.01 g)，分別移取濃度為10 μg/mL的克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL、150 μL、500 μL于空白樣品中，每組濃度重復(fù)3次，配成低、中、高濃度的待測樣品加標(biāo)液，按本試驗(yàn)方法測定，計(jì)算加標(biāo)回收率。克百威加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3，加標(biāo)試驗(yàn)色譜圖見圖4。

圖4 大米粉加標(biāo)試驗(yàn)色譜圖

表3 克百威加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，克百威低、中、高濃度平均回收率分別為78.7%、84.5%、93.3%，RSD分別為5.3%、4.6%、3.3%，表明該試驗(yàn)方法回收率穩(wěn)定。

2.6 最佳操作條件的選擇

2.6.1提取溶劑的選擇

氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留量的分析常用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑[6]。因此，分別選擇乙腈:水、甲醇:水、丙酮:水、乙酸乙酯:水作為提取溶劑，溶劑體積比均為1∶1，相同試驗(yàn)條件下，加標(biāo)濃度為0.50mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 不同溶劑提取效果比較

表4的試驗(yàn)結(jié)果表明，使用乙腈∶水(1∶1，v/v)、甲醇∶水(1∶1，v/v)的回收率分別為93.3%和90.2% ，丙酮∶水(1∶1，v/v)、乙酸乙酯∶水(1∶1，v/v)作為提取溶劑的回收率分別為72.5%和65.3% ，前兩種選擇明顯高于后兩種。用乙腈∶水(1∶1，v/v)提取的樣品基質(zhì)干擾較小，考慮到綜合提取效率、選擇性和滲透能力等因素，本方法采用乙腈∶水(1∶1，v/v)作為提取溶劑。

2.6.2固相萃取柱的選擇

大米粉主要含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等物質(zhì)，基質(zhì)較復(fù)雜。由于克百威極性較大，采用QuEChERS前處理后雜峰較多，須采用固相萃取柱進(jìn)行凈化[7]。主要研究了氨基固相萃取柱、C18固相萃取柱、氟羅里硅土柱的凈化情況。在大米粉中添加已知量的克百威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，采用C18固相萃取柱、氟羅里硅土柱凈化的回收率分別為73%和67%，且雜峰較多。氨基固相萃取柱能有效吸附淀粉等糖類物質(zhì)，回收率較高且干擾較小。

2.6.3流動(dòng)相的選擇

為了獲取最優(yōu)分離效果，考慮到待測溶液最后由甲醇定容，因此根據(jù)溶劑的性質(zhì)，選擇研究了甲醇、水不同配比作為流動(dòng)相的色譜分離情況；研究了梯度洗脫條件對色譜分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇∶水(1∶9，v/v)作為起始流動(dòng)相，后逐漸增加有機(jī)相比例，當(dāng)甲醇∶水(7∶3，v/v)時(shí)，克百威開始出現(xiàn)色譜峰，在此色譜條件下，克百威的保留時(shí)間在10.1～10.2 min，最后逐漸減少甲醇的比例，回到流動(dòng)相起始比例，可以有效分離克百威。

3 結(jié)論

利用QuEChERS專用鹽包前處理大米粉等谷物樣品，經(jīng)氨基固相萃取柱純化，高效液相色譜柱后衍生法測定克百威含量是一種前處理簡單、快速、定量準(zhǔn)確的檢測方法。該方法線性良好，準(zhǔn)確度和精密度較高，重復(fù)性和回收率均較好，該方法適用于大米粉中克百威含量的測定。