柴黃清胰活血顆粒提取工藝研究*

趙 劍，李 靜，羅 群，李能源，李 志

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

柴黃清胰活血顆粒為我院協(xié)定處方，由生大黃、柴胡、延胡索、丹參、梔子、黃芩、白芍等14 味中藥組方，具有清熱解毒、活血消腫、通腑泄熱、理氣止痛功效，主要用于治療急性胰腺炎。方中大黃為君藥，可抑酶，抑菌，導(dǎo)瀉，改善胰腺微循環(huán)，抑制內(nèi)毒素產(chǎn)生，保護胃腸黏膜屏障，抑制腸道內(nèi)細菌和毒素易位，降低胃腸黏膜和腸血管的通透性，恢復(fù)腸道功能，糾正呼吸功能受損患者的低氧血癥，降低多器官功能不全綜合征、多器官功能衰竭、感染及消化道出血的發(fā)生率，提高存活率，改善急性壞死性胰腺炎的預(yù)后［1－3］。本研究中以大黃中的指標性成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量為評價指標，優(yōu)選了柴黃清胰活血顆粒的提取工藝。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有SPD－20A 型紫外－可見光檢測器，LCsolution 型色譜工作站；JPGT0328 型超聲提取器（武漢嘉鵬電子有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；HH 型數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；ZK072型電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）；AUW120D 型電子天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

蘆薈大黃素對照品（批號為110795－201308，含量為 99.8%），大黃酸對照品（批號為 0757－200206，含量為 99.5%），大黃素對照品（批號為110756－200110，含量為98.3%），大黃酚對照品（批號為110796－201118，含量為99.1%），大黃素甲醚對照品（批號為110758－201415，含量為98.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；生大黃、柴胡、延胡索、丹參、梔子、黃芩、白芍等14 味中藥材購自瀘州天植中藥飲片公司，經(jīng)四川省瀘州市藥品檢驗所中藥室袁常珍主任中藥師鑒定為正品，均符合2015 年版《中國藥典（一部）》項下規(guī)定；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 5 種大黃指標性成分含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗［4－7］

色譜柱：Inertsil ODS－SP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －0.1%磷酸水溶液（85 ∶15，V ／ V）；流速：0.8 mL ／min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。理論板數(shù)分別按成分計算均不低于4 000，且分離度良好。

2.1.2 溶液制備

取蘆薈大黃素 1.9mg、大黃酸 4.9mg、大黃素 2.9mg、大黃酚 1.7 mg、大黃素甲醚 8.2 mg，精密稱定，分別置25，50，25，25，100 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，得上述成分質(zhì)量濃度分別為 0.076，0.098，0.116，0.068，0.082 mg ／mL，即得對照品貯備液。精密量取各對照品貯備液1 mL，置5 mL 容量瓶中，加入甲醇，搖勻，備用，即得混合對照品溶液。

按處方量并以相同工藝制備不含大黃的陰性對照樣品，取10 g，精密稱定，加甲醇50 mL，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，濾過，取續(xù)濾液，即得陰性對照品溶液。

分別采用傳統(tǒng)水煎、粉碎－滲漉－水煎、滲漉－水煎3 種工藝提取柴黃清胰活血顆粒中14 味中藥材，取上述3 種工藝制備的顆粒各10 g，精密稱定，加甲醇50 mL，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液1，2，3。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各 10 μL，按 2.1.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果陰性對照品溶液色譜圖中，在與對照品溶液及供試品溶液色譜對應(yīng)保留時間處無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 柴黃清胰活血顆粒中5 種大黃指標性成分的高效液相色譜圖1. aloe － emodi 2.rhein 3.emodin 4.chrysophanol 5.physcionA.Mixed reference solution B.Test solution C. Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of five active ingredients in Chaihuang Qingyi Huoxue Granules

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2 項下對照品貯備液1 mL，置同一5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，再分別量取 1，3，6，10，13，16，20 μL，按 2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以進樣量（ X，μg）為橫坐標、峰面積（ Y）為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。結(jié)果見表1。

表1 5 種大黃指標性成分的線性關(guān)系考察結(jié)果（n ＝7）Tab.1 Results of linear relation test of five active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma（n ＝ 7）

精密度試驗：精密吸取2.1.2 項下混合對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件于 1 d 內(nèi)重復(fù)進樣 5 次測定峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的 RSD 分別為 1.44% ，1.41% ，1.41% ，1.47%，0.62%（n ＝5），表明儀器日內(nèi)精密度良好。精密吸取 2.1.2 項下混合對照品溶液，按 2.1.1 項下色譜條件連續(xù)5 d 各進樣測定1 次，記錄峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的 RSD 分別為 1.51%，1.36%，1.43%，1.42%，0.71% （n ＝5），表明儀器日間精密度良好。

檢測限與定量限確定：取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的對照品貯備液，分別稀釋，進樣測定，以信噪比（S／ N）為3 時的質(zhì)量濃度為檢測限，以 S／ N為10 時的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的檢測限和定量限分別為0.019 0 μg ／mL 和 0.058 0 μg ／mL，0.024 5 μg ／mL 和0.074 7 μg ／mL，0.029 0 μg ／mL 和 0.088 5 μg ／mL，0.017 0 μg ／mL 和 0.051 9 μg ／mL，0.020 5 μg ／mL 和0.062 5 μg ／mL。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時各進樣10 μL，測定峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的 RSD 分別為 1.20% ，0.66% ，1.70% ，1.19% ，1.91% （n ＝6），表明供試品溶液在室溫下12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一供試品溶液6 份，每份10 mL，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，并計算含量。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的 RSD 分別為1.49%，1.49%，1.80%，1.41%，1.48%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

回收試驗：取已知含量的樣品5 g，精密稱定，平行9 份，每3 份為1 組，分別按5 種大黃指標性成分含量的50%，100%，150%加入蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品，依法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，并計算回收率。結(jié)果上述成分的平均回收率分別為102.08%，101.23%，101.00% ，102.90% ，99.66% ，RSD 分別為 2.70% ，2.25%，1.93% ，2.19% ，2.62% （ n ＝ 9）。

耐用性試驗：取樣品適量，依法制備供試品溶液，色譜條件小幅變化，流速為（0.8 ± 0.2）mL ／min，檢測波長為（254 ±2）nm，柱溫為（40 ± 5）℃［8］，測定含量。結(jié)果的RSD 分別為 1.32%，0.99%，1.23%，1.19%，1.05%，表明采用高效液相色譜法測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量時，流速、波長、柱溫小幅變化，耐用性滿足系統(tǒng)適用性試驗的要求，方法可靠。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 傳統(tǒng)水煎工藝

按處方比例稱取中藥材，采用傳統(tǒng)水煎法提取有效成分，以浸泡時間、加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的總含量為評價指標，采用 L9（34）正交試驗法優(yōu)選最佳工藝條件。參考文獻［9］并結(jié)合試驗結(jié)果，最終確定最佳工藝為加 10 倍量水，浸泡 30 min，煎煮 3 次，每次 60 min。按最佳提取工藝加水提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮至密度為1.20 的稠浸膏，加入適量糊精，制得顆粒1。

2.2.2 粉碎－滲漉－水煎提取工藝

將處方中生大黃粉碎，制粒時為母粒。將處方中延胡索、丹參滲濾提取，以乙醇濃度、浸泡時間、加乙醇量、滲漉流速為考察因素，以干浸膏、胡索乙素含量為評價指標，采用 L9（34）正交試驗法優(yōu)選乙醇滲漉工藝最佳條件。參考文獻［10］并結(jié)合試驗結(jié)果，最終確定最佳工藝為加10 倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL／min 的速率滲漉。滲漉后，藥渣與柴胡、梔子、黃芩等13 味中藥材采用傳統(tǒng)水煎法提取有效成分，以浸泡時間、加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，以梔子苷的轉(zhuǎn)移率為評價指標，采用 L9（34）正交試驗法優(yōu)選最佳工藝條件。參考文獻［9］并結(jié)合試驗結(jié)果，最終確定最佳工藝為加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮3 次，每次60 min。按最佳滲濾工藝提取延胡索、丹參，收集滲濾液，濃縮成稠浸膏，備用。將滲濾后的藥渣與柴胡、梔子、黃芩等13 味中藥材按最佳傳統(tǒng)水煎工藝提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮至少量，加入滲濾液稠浸膏，繼續(xù)濃縮至密度為1.15 的稠浸膏，加入生大黃粉和糊精，制得顆粒2。

2.2.3 滲漉－水煎提取工藝

滲漉提取處方中的延胡索、丹參，以乙醇體積分數(shù)、浸泡時間、加醇量、滲漉流速為考察因素，以干浸膏、延胡索乙素含量為評價指標，采用 L9（34）正交試驗法優(yōu)選乙醇滲漉工藝最佳條件。參考文獻［11］并結(jié)合試驗結(jié)果，最終確定最佳工藝為加10 倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL／min 的速率滲漉。生大黃加10 倍量80%乙醇，浸泡 17 h，收集 7 倍量的滲漉液［12］。將上述丹參、延胡索滲漉液和生大黃滲漉液分別進行濃縮，濃縮至稠浸膏，備用。將丹參、延胡索、生大黃滲漉后的藥渣及柴胡、梔子、黃芩等11 味中藥材采用傳統(tǒng)水煎法提取，以浸泡時間、加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)為考察因素，以梔子苷的轉(zhuǎn)移率為評價指標，采用 L9（34）正交試驗法優(yōu)選最佳工藝條件。參考文獻［10］并結(jié)合試驗結(jié)果，確定最佳工藝為加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮3 次，每次60 min，將滲濾后的藥渣與柴胡、梔子、黃芩等11 味中藥按最佳傳統(tǒng)水煎工藝提取，濾過，合并濾液，減壓濃縮至少量，加入上述滲濾液稠浸膏，繼續(xù)濃縮至密度為1.20 的稠浸膏，加入適量糊精，制得顆粒3。

2.3 不同工藝提取結(jié)果比較

傳統(tǒng)水煎提取工藝操作較簡單，為首選工藝，含量測定時發(fā)現(xiàn)5 種指標性成分含量及總量均較低，與其水溶性較小相符。改進后，采用粉碎－滲漉－水煎提取工藝，但在沸騰制粒及干燥工藝過程中發(fā)現(xiàn)生大黃粉損失較大。滲漉－水煎提取工藝可避免生大黃粉的損失，含量測定結(jié)果與預(yù)期一致。

由表2 可知，傳統(tǒng)水煎提取工藝所得顆粒1 中各成分的總含量為0.466 4 mg／g，粉碎－滲濾－水煎工藝所得顆粒2 中各成分的總含量為0.720 0 mg／g，滲濾－水煎提取工藝所得顆粒3 中各成分的總含量為0.835 7 mg／g。分析各成分的轉(zhuǎn)移率，顆粒3 中各成分的轉(zhuǎn)移率均較高，故選擇滲漉－水煎提取工藝。

表2 3 種提取工藝的5 種生大黃指標性成分含量及轉(zhuǎn)移率比較（mg／g，n ＝2）Tab.2 Comparison of contents and transfer rates of five active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma extracted by the three extraction processes（mg ／g，n ＝2）

3 討論

原國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2018 年2 月9 日發(fā)布的《總局關(guān)于對醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑實施備案管理的公告》中指出，醫(yī)療機構(gòu)開發(fā)新制劑從研究成本、申報難易度考慮，按備案制要求申報更容易。但傳統(tǒng)水煎提取工藝中5 種生大黃指標性成分的平均含量均較低，臨床療效不佳，故淘汰該工藝。

柴黃清胰活血顆粒處方中生大黃、延胡索、丹參所含有效成分易溶于有機溶劑，不溶或難溶于水［13－18］，故對上述3 味中藥材進行醇提。生大黃為方中君藥，粉碎，制粒時為母粒，延胡索乙素、丹參采用滲漉工藝，在沸騰制粒及干燥時生大黃均有損失，后期動物實驗中，將生大黃粉碎成細粉，加入浸膏中灌胃小鼠，易堵塞灌胃針，且患者也不易服用，故淘汰粉碎－滲漉－水煎提取工藝。

本研究中采用滲漉－水煎提取工藝，即生大黃用80%乙醇滲漉，丹參、延胡索用55%乙醇滲漉，滲漉后的藥渣與處方中的其余藥材一起加水煎煮，制得顆粒中生大黃指標性成分的總含量最高，各成分轉(zhuǎn)移率均較高，提示該工藝較優(yōu)。醫(yī)療機構(gòu)新制劑必須依據(jù)注冊制方案申報，要求完成藥效動力學(xué)試驗與安全性評價試驗，但費用較高。自2015 年四川省實行新版醫(yī)療機構(gòu)新制劑注冊制管理辦法以來，尚無醫(yī)療機構(gòu)新制劑注冊成功，是否按滲漉－水煎提取工藝申報醫(yī)療機構(gòu)新制劑有待商榷。