虎杖中蒽醌類和二苯乙烯類成分閃式提取工藝優化

朱 芹，黃湘杰

（1. 湖南省湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411000； 2. 湖南省湘鄉市人民醫院藥劑科，湖南 湘潭 411400）

虎杖源于蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.Et Zucc. 的干燥根莖和根，又名紅三七，始載于《本草綱目》［1］，我國資源量大，具有利濕退黃、止咳化痰、散瘀止痛功效，臨床常用于治療濕熱黃疸、風濕痹痛、水火燙傷、跌打損傷、肺熱咳嗽等癥［2］。虎杖含有二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類等多種活性成分，前2 種活性成分具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、調節代謝等多種藥理學作用。2020 年版《中國藥典（一部）》中虎杖的含量測定指標性成分為大黃素和虎杖苷，大黃素和大黃素甲醚屬蒽醌類，白藜蘆醇和虎杖苷屬二苯乙烯類［3－5］。目前，虎杖有效成分的提取方式主要有煎煮法、酶解法、超聲提取法［6－7］等，均存在耗時長、操作煩瑣等缺點，且二苯乙烯類成分遇熱不穩定，易降解［8］。閃式提取法在室溫下利用超動分子滲透技術和高速剪切力，快速、高效地將中藥材粉碎，并使有效成分迅速溶解平衡，達到高效提取目的［9－10］；Plackett－Burman（PB）試驗可快速、有效地篩選出最明顯的關鍵影響因素［11］，Box － Behnken Design（BBD）響應面法可解決非線性數據問題。本研究中采用閃式提取法提取虎杖的有效成分，通過PB 試驗篩選出顯著影響因素，采用BBD 響應面法優化虎杖中蒽醌類和二苯乙烯類成分的最佳提取工藝，為進一步開發虎杖的藥用價值奠定基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

E2695 型高效液相色譜儀（美國 Waters 公司），配有四元超高壓溶劑系統、2695 型自動進樣器、2998 PDA 型二極管陣列檢測器、Empower3 型色譜工作站；AUW－220D型電子天平（日本島津公司，精度為0.01 mg）；JHBE－50C 型閃式提取器（西安麒麟實驗儀器有限公司，功率為 3 000 W，轉速為 10 000 r／min）；Milli－ QAcademic 型超純水系統（美國密理博公司）。

1.2 試藥

大黃素對照品（批號為110756－201912，含量為98.9%），大黃素甲醚對照品（批號為 110758－201817，含量為99.5%），虎杖苷對照品（批號為 11575－201803，含量為 89.5% ），白藜蘆醇對照品（批號為 111535 －201903，含量為99.3%），均購自中國食品藥品檢定研究院；虎杖藥材購自河北省安國中藥材專業市場，經湖北省食品藥品研究院蔡波主任藥師鑒定為正品；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 提取工藝

取干燥的虎杖藥材適量，粉碎，過4 號篩，取粉末50 g，精密稱定，投入閃式提取器中，設置儀器參數，加入溶劑適量，充分提取，提取液減壓濃縮至近干，真空干燥，得藥材浸膏粉末。

2.2 虎杖 4 種指標性成分含量測定［12－14］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：WatersXterraC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.18% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 9 min 時 11%A，9 ～ 25 min 時 11%A→45%A，25 ～35 min 時 45%A→66%A，35 ～48 min 時 66%A→82%A，48 ～ 60 min 時 82%A→10%A）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：254 nm（大黃素和大黃素甲醚），303 nm（白藜蘆醇和虎杖苷）；柱溫：28 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇和虎杖苷對照品各適量，精密稱定，以甲醇為溶劑配制質量濃度分別為0.102 3，0.241 5，0.337 8，0.516 9 mg ／mL 的混合對照品溶液，經 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，備用。取2.1 項下制備的浸膏粉末 1.0 g，精密稱定，置 100 mL 棕色容量瓶中，加75%乙醇溶解并定容，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察與定量限確定：分別精密吸取2.2.2項下混合對照品溶液 2，5，10，15，20，25 μL，按 2.2.1項下色譜條件進樣測定。以混合對照品溶液進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。結果大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇和虎杖苷的回歸方程分別為 Y1＝101.18 X1－22.73（r1＝0.999 6），Y2＝ 68.65 X2＋ 19.36（r2＝ 0.999 5），Y3＝94.24X3－18.19（r3＝0.999 7），Y4＝70.16 X4＋9.83（r4＝0.9998），線性范圍分別為 0.2046 ～2.5580μg、0.483 0 ～6.037 0 μg、0.675 6 ～ 8.445 0 μg、1.034 0 ～12.920 0 μg。表明大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷在各自線性范圍內與峰面積線性關系良好。精密量取2.2.2 項下混合對照品溶液各適量，用甲醇倍比稀釋，按2.2.1 項下色譜條件進樣分析，取峰面積信噪比（ S ／ N）為 10 ∶1 時混合對照品溶液的進樣量為定量限，結果定量限分別為1.76，3.28，6.44，9.20 ng。

穩定性試驗：取 2.2.2 項下供試品溶液，分別于0，6，12，15，20，24 h 時按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷峰面積的 RSD 分別為 0.88% ，1.03% ，0.91% ，0.96%（n ＝ 6），表明供試品溶液在室溫下 24 h 內穩定。

精密度試驗：精密量取2.2.2 項下混合對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇和虎杖苷峰面積的 RSD 分別為 0.67% ，0.54% ，0.73% ，0.49%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：取2.1 項下已知含量的虎杖浸膏粉適量，精密稱定，共 6 份，分別精密加入 2.2.2 項下混合對照品溶液 2.0 mL，依法制備供試品溶液，按 2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的平均回收率分別為 99.89% ，99.12%，99.65%，99.71%，RSD 分別為0.71% ，0.89% ，1.01%，0.97% （n ＝6），表明方法準確可靠。

2.3 PB 試驗篩選主要影響因素

PB 試驗設計：按PB 試驗設計表設置儀器參數，采用Design Expert 8.0.5 軟件擬合影響大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷提取率的二次回歸方程，作出相互作用影響4 種有效成分提取率的3D 響應面圖和2D 等高線圖，并預測4 種有效成分提取率的最大理論值。選定的6 個影響因素為乙醇體積分數（因素A，%），提取次數（因素 B，次），液料比（因素 C，mL ／g），藥材粒度（因素 D），提取時間（因素 E，min），提取溫度（因素F，℃），PB 試驗設計因素水平見表 1。

結果與分析：取12 份虎杖藥材，各100 g，置閃式提取器中，按表1 的試驗設計快速提取，并測定大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率。結果見表2。由表3 可知，模型顯著；各因素對大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率影響的顯著性順序依次為提取時間（E） ＞ 料液比（C） ＞ 乙醇體積分數（A） ＞ 提取次數（B） ＞ 藥材粒度（D） ＞ 提取溫度（F）。其中，對蒽醌類成分和二苯乙烯類成分提取率影響較顯著的因素為因素A，C，E，故上述3 個關鍵因素進行響應面優化和設計。

表1 PB 試驗設計因素水平表Tab.1 Factors and levels of the PB test

表2 PB 試驗設計及結果Tab.2 Design and results of the PB test

表3 PB 試驗設計各因素水平顯著性分析Tab.3 Significance analysis of each factor level according to the PB test

2.4 最陡爬坡試驗設計及結果

本研究中采用提取時間（步長設為2 min）、液料比（步長設為 10 mL ／g）、乙醇體積分數（步長設為 5%）3 個自變量設置正向爬坡模式，以大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率為觀察值尋求最優參數值。結果見表4。

由表4 可知，第4 次試驗時，大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率最大，分別為6.762，4.095，8.095，12.888 mg／g，即提取參數為液料比 40 mL ／g，提取12 min，乙醇體積分數65%。

表4 最陡爬坡試驗設計與結果Tab.4 Design and results of the steepest ascent test

2.5 BBD 響應面法優化試驗

2.5.1 BBD 響應面法設計

BBD 響應面法采用多元二次回歸方程模型預測各擬合響應值與最優因素間的試驗條件及數理函數關系［15］。根據最陡爬坡試驗結果，并結合BBD 響應面法原理，以乙醇體積分數（因素A）、液料比（因素C）、提取時間（因素E）為考察因素，以虎杖提取物中大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷提取率的加權評分（OD）值為評價指標，運用Design Expert 8.0.5 統計學軟件，設計虎杖提取工藝三因素三水平響應面分析模型，對二次多項方程進行顯著性分析。BBD 響應面法設計因素水平見表5。

表5 BBD 響應面法設計因素水平表Tab.5 Factors and levels of BBD response surface method

2.5.2 回歸模型的建立及分析

采用2.2.1 項下方法測定17 組試驗大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率，根據Hassan 法計算各試驗4 個指標性成分的 OD 值，并對模型進行綜合分析。結果見表6 至表7。

表6 BBD 響應面法設計與結果Tab.6 Design and results of the BBD response surface method

采用 Design Expert 8.0.5 統計學軟件進行方差分析，得二次多項回歸方程 Y ＝0.75 ＋ 0.22 A ＋ 0.33 C ＋0.021E ＋0.028AC ＋0.076AE －0.008 255CE －0.24A2－0.052 C2－ 0.16 E2。式中，因變量為大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇和虎杖苷提取率 OD 值，因素A，C，E 分別為自變量乙醇體積分數、液料比及提取時間。綜合評價OD 值的相關系數 R2＝ 0.992 8，數學模型擬合良好。由表 7 可知，所建立模型有意義（P＜ 0.01），表明模型擬合度高，預測性較好。因素A 和因素C 對模型影響均顯著。模型驗證得大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率預測值分別為 6.902，5.158，9.799，13.890 mg ／g。

表7 BBD 響應面法設計方差分析結果Tab.7 Results of ANOVA of the BBD response surface method

2.5.3 BBD 響應面法分析與最佳工藝確定

采用 Design Expert 8.0.5 軟件，繪制影響 OD 值的各因素相互作用的3D 響應面圖和2D 等高線圖。由圖1可知，曲線面升降變化均較明顯，因素A，C，E 之間顯著交互。最佳提取工藝條件為，乙醇體積分數68%，液料比35 mL／g，提取10 min。取虎杖藥材3 份，按最佳提取工藝提取，實測大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率分別為 6.867，5.127，9.736，13.850 mg／g，RSD 分別為 0.41% ，0.63% ，0.71% ，0.58% （n ＝3），預測值和實則值偏差分別為 0.25%，0.30%，0.32%，0.14%。

圖1 各因素交互作用的3D 響應面圖和2D 等高線圖Fig.1 3D response surface plot and 2D contour plot of the interaction of various factors

3 討論

由圖1 可知，提取時間顯著影響 OD 值，在各曲線圖中均是先低后高，而乙醇體積分數和液料比曲線面隨自變量增加呈上升趨勢。預測值與實測值偏差較小，表明理論模型預測較準確，優選提取工藝可行。

曾考察影響大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷提取率綜合評價指標相互作用的三因素（乙醇體積分數、提取時間、液料比），通過PB 試驗聯合BBD 響應面法進行試驗設計，采用Design Expert 8.0.5 統計學軟件擬合二次多項方程，采用方差分析擬合程度，推導最佳提取工藝條件，并預測大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、虎杖苷的提取率。由含量測定方法學考察結果可知，方法準確可靠，精密度、穩定性均較好，可準確測定虎杖中蒽醌類和二苯乙烯類成分的含量；由提取工藝優化結果可知，液料比對提取率影響較大，乙醇體積分數為68 %，液料比為35 mL／g，提取時間為10 min，基本可將蒽醌類有效成分提取完全，可為虎杖中蒽醌類和二苯乙烯類成分的提取提供參考。