正交試驗優(yōu)選抗風止痛寧提取工藝*

晏 菲，王景媛，曾永成，高佳蓉，強選萍，史亞軍

（陜西中醫(yī)藥大學藥學院·陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046）

類風濕關節(jié)炎（RA）屬中醫(yī)痹證范疇?！饵S帝內經(jīng)·素問·痹論》曰：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也?！憋L、寒、濕、熱等外邪侵襲人體，邪留關節(jié)，經(jīng)脈氣血閉阻不通，不通則痛。RA 患者疼痛、水腫、四肢麻木等體征大都表露于體膚，針對寒濕痹阻癥患者，以中藥外用，如熏洗、外敷、蠟療、艾灸等［1－4］，直接作用于皮膚或黏膜，吸收更快，直達病所，發(fā)揮舒筋活血、通絡止痛、驅邪外出的作用［5］?？癸L止痛寧酊劑是我校附屬醫(yī)院治療寒濕痹阻型RA 的臨床經(jīng)驗方，由丹參、紅花、三七、全蝎、生川烏、伸筋草等藥材組方，原工藝采用傳統(tǒng)制備方法，將上述藥材用白酒（規(guī)定濃度）浸泡地藏1 ～3 個月而得，此法生產(chǎn)周期較長，提取工藝缺乏科學的評價手段和方法。為進一步規(guī)范制劑的制備工藝，本研究中采用正交試驗法，以乙醇為提取溶劑，丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 和總固體含量為綜合評價指標，優(yōu)化抗風止痛寧的提取工藝，為其現(xiàn)代制劑開發(fā)提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U－3000 型高效液相色譜儀（美國 Thermo Fisher公司）；BT－25S 型電子天平（賽多利斯＜上海＞貿易有限公司，精度為十萬分之一）；DHG－9140 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

丹參酮ⅡA對照品（批號為 110766 －201721，含量≥99.5%），羥基紅花黃色素A 對照品（批號為111637－201810，含量≥93.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙醇為分析純，甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純，水為娃哈哈純凈水。丹參、紅花、三七、全蝎、生川烏、伸筋草飲片（陜西興盛德飲片有限公司，批號分別為20180107，20180825，20180921，20180910，20180910，201800927）。

2 方法與結果

2.1 丹參酮ⅡA 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 水（75 ∶25，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

取丹參酮ⅡA對照品 6.13 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，以甲醇溶解并定容，即得質量濃度為122.6 μg／mL 的丹參酮ⅡA對照品溶液。采用浸漬法提取，將浸出液濾過，濃縮至每100 mL 相當于原飲片10 g（總處方量），即得樣品溶液；精密量取樣品溶液25 mL，減壓回收溶劑，殘渣加甲醇溶解并定容至25 mL，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取 2.1.2 項下丹參酮ⅡA對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數(shù)按丹參酮ⅡA計應不低于3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 丹參酮ⅡA 高效液相色譜圖1. tanshinone ⅡAA. Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms of tanshinone ⅡA

線性關系考察：精密量取丹參酮ⅡA對照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以丹參酮ⅡA質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y ＝134.19 X ＋ 28.911（r ＝ 0.999 7，n ＝7）。結果表明，丹參酮ⅡA質量濃度在 6.13 ～ 36.78 μg ／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限確定：精密量取 2.1.2 項下丹參酮ⅡA對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比（ S ／ N）為 3 ∶1 時計算檢測限。結果丹參酮ⅡA的檢測限為 0.01 μg／mL。

精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收試驗：按規(guī)定方法進行試驗。結果精密度試驗的 RSD 為0.71%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗的 RSD 為1.91%，表明室溫下供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定；重復性試驗的 RSD為1.25%，表明方法重復性良好；平均加樣回收率為99.03%，RSD 為 0.96%（n ＝6），表明方法準確度良好。

2.2 羥基紅花黃色素A 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：BD Hypersil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 乙腈 － 0.7% 磷酸水溶液（26 ∶2 ∶72，V ／ V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：403 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取羥基紅花黃色素 A 對照品 3.07 mg，精密稱定，置 50 mL 容量瓶中，以甲醇溶解并定容；取1 mL置50 mL 容量瓶中，以甲醇定容，即得質量濃度為12.28 μg ／mL 的羥基紅花黃色素 A 對照品溶液。精密量取2.1.2 項下樣品溶液1 mL，減壓回收溶劑，殘渣加甲醇溶解并定容至100 mL，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2.2 項下羥基紅花黃色素A對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數(shù)以羥基紅花黃色素A 計應不低于 3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖2。

圖2 羥基紅花黃色素A 高效液相色譜圖1. hydroxysafflor yellow AA. Reference solution B.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms of hydroxysafflor yellow A

線性關系考察：精密吸取羥基紅花黃色素A 對照品溶液 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 10 mL容量瓶中，加甲醇定容，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以羥基紅花黃色素 A 質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y ＝26.767 X －1.364 4（r ＝0.999 8，n ＝7）。結果表明，羥基紅花黃色素 A 的質量濃度在0.61 ～ 6.14 μg ／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限與檢測限確定：精密量取2.2.2 項下羥基紅花黃色素A 對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S ／ N）分別為 10 ∶1 和3∶1 時計算定量限和檢測限。結果，羥基紅花黃色素A 的定量限和檢測限分別為 0.012 μg ／mL 和 0.005 μg ／mL。

精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收試驗：按規(guī)定方法進行試驗。結果精密度試驗的 RSD 為0.86%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗的 RSD 為1.78%，表明室溫下供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定；重復性試驗的 RSD為2.31%，表明方法重復性良好；平均加樣回收率為101.75%，RSD 為 1.16%（n ＝6），表明方法準確度良好。

2.3 總固體含量測定

參照2020 年版《中國藥典（四部）》通則“固體總量測定法”，計算總固體含量（%）。精密量取樣品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算供試品中總固體含量（%）。

2.4 單因素考察

乙醇體積分數(shù)：取處方量藥材粗粉5 份，分別加10倍量50%，60%，70%，80%，90%乙醇浸漬3 d，綜合評分顯示，在乙醇體積分數(shù)為70%時達到最大值。故選擇乙醇體積分數(shù)因素的三水平分別為60%，70%，80%。

乙醇用量：取處方量藥材粗粉5 份，分別加入5，10，15，20，25 倍 70%乙醇浸漬 3 d，綜合評分顯示，隨著乙醇用量的增加，綜合評分逐漸升高，但當乙醇用量超20 倍后增加不明顯。故選擇乙醇用量的三水平分別為15，20，25 倍。

浸漬時間：取處方量藥材粗粉5 份，加入10 倍量70% 乙醇，分別浸漬 1，2，3，4，5 d，綜合評分顯示，在提取1 ～3 d 時逐漸升高，4 d 以上時基本無變化。綜合提取次數(shù)的影響，從提高效率方面考慮，故選擇浸漬時間的三水平分別為 2，3，4 d。

提取次數(shù)：取處方量藥材粗粉5 份，分別加入10 倍量 70%乙醇，浸漬 3 d 為 1 次，分別考察提取 1，2，3，4，5 次的情況。綜合評分顯示，在提取1 ～3 次時升高，提取3 次后基本無變化，說明3 次時已基本提取完全。故選擇提取次數(shù)的三水平分別為1，2，3 次。

2.5 正交試驗

以丹參酮ⅡA含量（Ⅰ）、羥基紅花黃色素A 含量（Ⅱ）、總固體含量（Ⅲ）及綜合評分（Ⅳ）為評價指標，采用綜合加權評分法［6］，根據(jù)影響提取工藝因素的大小、權重系數(shù)分別記為 0.4，0.4，0.2，綜合評分 ＝丹參酮ⅡA含量 ／丹參酮ⅡA含量max×0.4 ×100 ＋羥基紅花黃色素A含量 ／羥基紅花黃色素 A 含量max×0.4×100 ＋總固體含量 ／總固體含量max×0.2×100。以乙醇體積分數(shù)（A）、乙醇用量（B）、浸漬時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，設計 L9（34）正交試驗。結果見表1 至表3。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels the L9（34） orthogonal test

由表2 和表3 可知，各因素對提取效果的影響強度依次為乙醇體積分數(shù)＞提取次數(shù)＞浸漬時間＞乙醇用量，最佳參數(shù)為A2B3C2D3；僅A 因素對提取有顯著影響。從節(jié)約能源和提高效率的角度出發(fā)，選擇最佳提取工藝為A2B1C2D3，即加15 倍量70%乙醇，浸漬3 次，每次3 d，將浸出液濾過、濃縮，調整至含醇量為70%，且每100 mL 相當于原飲片（總處方量）10 g。

表2 L9（34）正交試驗設計方案及結果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結果Tab.3 Results of ANOVA

2.6 驗證試驗

按最佳提取工藝進行6 次平行試驗，并測定丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 及總固體含量。結果丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 和總固體的平均含量分別為0.016 2 mg／mL（RSD 為 1.23% ）、0.485 5 mg ／mL（RSD 為 1.38% ）和18.81%（RSD 為 2.06%）。結果表明，該工藝合理可行。

3 討論

該制劑處方藥材的主要有效成分為丹參中丹參酮類、紅花中黃酮類、三七中皂苷類、川烏和伸筋草中生物堿類等，為了確保有效成分提取率，參考文獻［7－8］和原工藝白酒浸泡地藏方法，本研究中采用乙醇浸漬提取。主藥丹參、紅花為經(jīng)典藥對，為活血化瘀之要藥。丹參中丹參酮ⅡA具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等作用［9－11］，紅花中羥基紅花黃色素A 具有抗血小板聚集、抗炎、鎮(zhèn)痛及抑制軟骨細胞凋亡的作用［12－16］，二者為主要指標性成分，總固體含量測定在中藥提取物質量和制劑有效成分含量控制上具有重要意義，故選擇丹參酮ⅡA、羥基紅花黃色素A 及總固體含量作為工藝優(yōu)化的評價指標。

優(yōu)化工藝中用70%乙醇提取，有利于有效成分的浸出，且乙醇無毒、價低易得，適合用于工業(yè)化大生產(chǎn)，在確保有效成分含量的同時大大提高了制劑效率、制劑質量和療效。臨床應用的大部分中藥制劑以經(jīng)驗配制為主，多數(shù)尚未完善提取工藝和質量標準，對其成分缺乏科學監(jiān)測，該類制劑提取工藝的考察能較好地解決這一問題，也為今后制劑配制的規(guī)范化與工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。