高效液相色譜法同時測定喉康散中靛藍和靛玉紅含量

李 玲，王婷婷，陳乃江

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222006）

喉康散處方來源于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑（第五冊）》，由冰片、硼砂、青黛、玄明粉、珍珠層粉等10 味中藥組方，用于治療急、慢性咽炎，喉炎，扁桃體炎，口腔潰瘍等咽喉疾病［1］。方中，青黛味咸，性寒，具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚等功效，主要活性成分為脂溶性成分靛藍和靛玉紅［2－5］。由于市售的青黛藥材質量差異大，造假嚴重，偽劣品較多［6］。現有質量標準中僅采用薄層色譜法對靛藍和靛玉紅進行定性鑒別，缺乏對制劑中有效成分的含量測定［1］。本研究中建立了同時測定喉康散中靛藍和靛玉紅含量的高效液相色譜法，以改進現有質量評價方法，確保產品質量可控。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），配有Waters 2998 光電二極管陣列（PDA）檢測器，Empower 色譜工作站；Sartorius BP211D 型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；KH－700DE 型數控超聲儀（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為700 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

靛藍對照品（批號為 110716－201612，純度為98.7%），靛玉紅對照品（批號為 110717 －201805，純度為99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；喉康散（市售，桂林葛仙翁藥業有限公司，批號分別為180407，181217，190112）；N，N －二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 0.05 moL ／L 醋酸銨溶液（75 ∶25，V ／ V）；流速：1.0 mL ／ min；檢測波長：289 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。取陰性對照品溶液、對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，理論板數按靛藍和靛玉紅峰計均不低于3 000，拖尾因子均不超過1.5。色譜圖見圖1。可見，靛藍與靛玉紅及相鄰色譜峰均能完全分離，且陰性對照無干擾。

圖1 高效液相色譜圖1.indigotin 2.indirubinA.Mixed reference solution B.Test solution C. Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

取靛玉紅對照品21.44 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加DMF 適量，超聲（功率為700 W，頻率為40 kHz）使溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為靛玉紅對照品貯備液。取靛藍對照品28.32 mg，精密稱定，置 200 mL 容量瓶中，加 DMF 適量，超聲使溶解，精密量取靛玉紅對照品貯備液10 mL，置同一200 mL 容量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液5 mL，置25 mL 容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得靛藍和靛玉紅質量濃度分別為28.32 μg ／mL 和 2.144 μg ／mL 的混合對照品溶液。取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入DMF 50 mL，密塞，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質量，用DMF 補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備不含青黛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取2.2 項下混合對照品貯備液 1，2，4，5，6，8，10 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，加DMF 稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述溶液分別進樣測定，以質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程：Y藍＝5.785 6 ×104X藍－5.048 8 ×104，r ＝0.999 9（ n ＝ 7）；Y紅＝ 6.365 7 × 104X紅－ 6.391 × 103，r ＝ 0.999 2（n ＝7）。結果表明，靛藍與靛玉紅質量濃度分別在5.664 ～56.640 μg／mL 和 0.428 8 ～ 4.288 0 μg ／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣6 次。結果靛藍和靛玉紅峰面積的 RSD 分別為 0.35% 和 0.68% （n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為181217）樣品，按2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，依法計算含量。結果靛藍和靛玉紅含量的 RSD 分別為 0.78% 和 1.14% （n ＝ 6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為181217）樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，18，24 h 時進樣測定，記錄色譜圖。結果靛藍和靛玉紅峰面積的 RSD 分別為 1.12% 和 1.86% （n ＝ 7），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號為181217）樣品 0.25 g，精密稱定，共 6 份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入2.2 項下混合對照品貯備液5 mL，依法制備供試品溶液。按2.1 項下色譜條件依法進樣測定靛藍和靛玉紅的含量，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.4 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 180407，181217，190112）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，并按外標法計算樣品中各成分的含量。結果3 批樣品中靛藍的含量分別為 2.81，2.78，2.89 mg ／g，靛玉紅的含量分別為 0.225，0.217，0.232 mg ／g。

3 討論

3.1 流動相選擇

采用高效液相色譜法測定靛藍和靛玉紅的含量，以待測色譜峰的峰形和與其他色譜峰的分離度作為考察指標，曾考察不同流動相（甲醇－水、乙腈－水、甲醇－醋酸銨體系、乙腈－醋酸銨體系、甲醇－磷酸鹽緩沖液、乙腈 －磷酸鹽緩沖液），發現以甲醇 － 0.05 moL ／L 醋酸銨溶液為流動相時，可滿足靛藍與靛玉紅的分離要求，且峰形好、柱效高。

3.2 樣品前處理過程選擇

靛藍和靛玉紅均為脂溶性成分，分別比較了甲醇、乙醇、三氯甲烷、DMF 及乙酸乙酯對樣品的提取效果。結果表明，DMF 提取效率最好，最終確定以DMF 作為提取溶劑。曾考察提取方法，比較了超聲提取法和回流提取法及在不同超聲時間時對樣品的提取效果，發現超聲提取法易于操作，簡便快捷，提取效果好。故最終確定以超聲提取30 min 作為提取條件。

3.3 檢測波長選擇

通過PDA 進行全波長光譜掃描，測得靛藍于285 nm波長處有最大吸收，靛玉紅于289 nm 波長處有最大吸收，由于樣品中靛藍與靛玉紅含量相差較大，靛玉紅的峰面積遠小于靛藍的峰面積。故選擇靛玉紅的最大吸收波長289 nm 作為2 種成分的共同檢測波長。

3.4 樣品含量測定結果分析

2015 年版《中國藥典（一部）》中規定青黛藥材中靛藍含量不得少于2.0%，靛玉紅含量不得少于0.13%。按照喉康散的質量標準［1］，方中青黛藥材占比為10.42%，按處方比例，計算制劑中靛藍的理論含量應不低于 0.208% （即 2.08 mg ／g），靛玉紅的含量應不低于0.013 5% （即 0.135 mg ／g）。結果表明，同一生產企業不同批號樣品中靛藍與靛玉紅的含量基本一致，且含量均符合藥典要求。

3.5 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便，結果準確可靠，專屬性強，穩定性和重復性均較好，可用于同時測定喉康散中靛藍和靛玉紅的含量。