一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中6 種成分的含量

張永昕，李莎恩，蔡琴琴，張 瑩，段付軍

（中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，廣東 廣州 510602）

補(bǔ)中益氣丸由黃芪、黨參、甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、陳皮、升麻、柴胡組方［1］，具有補(bǔ)氣健脾、升陷利濕功效，對(duì)免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及代謝相關(guān)疾病均有積極的治療作用［2－4］。補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制研究多為某一有效成分的含量測(cè)定，雖有多組分的測(cè)定研究，但該制劑成分復(fù)雜，操作過程煩瑣，所需對(duì)照品較多，成本較高，不易開展［5］。一測(cè)多評(píng)（QAMS）法是一種用于多成分質(zhì)量控制的分析方法，適用于評(píng)價(jià)中藥多組分的質(zhì)量［6－8］。本課題組在前期的薄層色譜和指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上［9－10］，建立了同時(shí)測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中黃芪有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷［11］，甘草有效成分甘草苷、甘草酸銨［12］，陳皮有效成分橙皮苷［13］，升麻、當(dāng)歸有效成分阿魏酸、異阿魏酸［14］6 種成分含量的QAMS 法，旨在為補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制提供科學(xué)、有效的新方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P680 型高效液相色譜儀（美國 Dionex 公司）；LPG－3400SDN 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；CPA225D 型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司，精度為十萬分之一）；KQ－400KDE 型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為400 W，頻率為 40 kHz）。

1.2 試藥

橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為C－006－150318－4，純度為 99.0%），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為 G－009－141110，純度為 98.7% ），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為 A －002－140727，純度為99.6%），異阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為Y－044－140801，純度為99.0%），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)為 M －020－150130－1，純度為 98.5%），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為G－003－150314，純度為98.3%），均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；黃芪、黨參、甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、陳皮、升麻、柴胡（廣州至信中藥飲片有限公司，批號(hào)均為20160711）；補(bǔ)中益氣丸（北京同仁堂制藥廠，批號(hào)分別為 13061479，14080835，14082972，15071479，15080026，15080047，15081358，15082109，15082417，15082679，15111047，16080747）；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純，超純水經(jīng)U 系列純水機(jī)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamosil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表 1；流速：0.8 mL ／min；柱溫：30 ℃ ；檢測(cè)波長：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、異阿魏酸、甘草苷、阿魏酸、甘草酸銨與其他成分均可達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)按目標(biāo)成分色譜峰計(jì)均大于4 000。色譜圖見圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 The elution program of the mobile phase

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Calycosin － 7 － O － β － D － glucoside 2. Liquiritin 3.Ferulic acid 4.Isoferulic acid 5.Hesperidin 6.Ammonium glycyrrhizinateFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備

取橙皮苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、異阿魏酸、甘草苷、阿魏酸、甘草酸銨對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇適量使溶解，制成質(zhì)量濃度分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.728 6 mg／mL、甘草苷 1.040 0 mg／mL、甘草酸銨1.000 0 mg／mL、阿魏酸 1.000 0 mg／mL、異阿魏酸1.040 0 mg ／mL、橙皮苷 0.400 0 mg ／mL 的單成分標(biāo)準(zhǔn)液。取各標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加甲醇制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸銨、阿魏酸、異阿魏酸、橙皮苷質(zhì)量濃度 分 別 為 3.643，15.600，57.000，1.500，15.600，120.000 μg ／mL 的混合對(duì)照品溶液。取樣品適量，研細(xì)，過80 目篩，取細(xì)粉2.0 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入100%甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，60 ℃超聲提取30 min，共2 次，靜置至室溫，再稱定質(zhì)量，用100%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，回收部分甲醇，將藥液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容，搖勻，即得供試品溶液。按處方比例，分別制備缺陳皮、甘草、黃芪、升麻和當(dāng)歸的陰性樣品，依法制備缺陳皮、甘草、黃芪、升麻和當(dāng)歸的陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取 2.2 項(xiàng)下溶液，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果各成分陰性對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間無顯著吸收，表明方法專屬性良好。

圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.calycosin － 7 － O － β－ D － glucoside 2.liquiritin 3.ferulic acid 4.isoferulic acid 5.hesperidin 6.ammonium glycyrrhizinateA.Test solution B.Negative reference solution lacking Citri Reticulatae Pericarpium C.Negative reference solution lacking Glycyrrhiza Radix et Rhizoma D.Negative reference solution lacking Astragali Radix E.Negative reference solution lacking Cimicifugae Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix F.Mixed reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specific test

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2 項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，共7 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以各成分質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為15082417）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于溶液制備后 0，4，8，12，18，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，并記錄待測(cè)成分的峰面積。結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為15082417）樣品，依法制備供試品溶液，共6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)成分的峰面積。結(jié)果見表2，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為15082417）樣品，粉碎，取粉末0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行9 份，隨機(jī)分為3 組，分別加入低、中、高3 種質(zhì)量濃度的各成分混合對(duì)照品溶液適量，每組平行3 份，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 補(bǔ)中益氣丸中6 種成分方法學(xué)考察結(jié)果Tab.2 Results of the methodological investigation of six components in Buzhong Yiqi Pills

2.4 相對(duì)校正因子（RCF）確定

RCF 計(jì)算：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，以橙皮苷為內(nèi)參物，在線性范圍內(nèi)按RCF 計(jì)算公式 fs／i＝fs／ fi＝ （Ci× As）／（Cs× Ai）分別計(jì)算橙皮苷對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、阿魏酸、異阿魏酸、甘草酸銨的RCF。式中，Cs 為內(nèi)參物的質(zhì)量濃度，As 為內(nèi)參物的峰面積，Ci為待測(cè)組分的質(zhì)量濃度，Ai為待測(cè)組分的峰面積［15］。結(jié)果見表 3。

表3 補(bǔ)中益氣丸中5 種成分的相對(duì)校正因子（以橙皮苷為內(nèi)參物）Tab.3 RCFs of five components in Buzhong Yiqi Pills（taking hesperidin as the internal reference）

RCF 的重復(fù)性：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，以橙皮苷為內(nèi)參物，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別采用不同品牌（Dionex P680 型、Thermo LPG － 3400SDN 型）高效液相色譜儀和不同品牌色譜柱（Diamosil C18柱、Kromasil C18柱）測(cè)定，考察其對(duì)RCF 的影響。結(jié)果見表4。

2.5 色譜峰定位方法考察

取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，以橙皮苷為內(nèi)參物，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算不同品牌（Dionex P680 型、Thermo LPG －3400SDN 型）高效液相色譜儀和不同品牌色譜柱（Diamosil C18柱、Kromasil C18柱）下其他5 種待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間差（ΔtR），即ΔtR待測(cè)成分／內(nèi)參物＝ ΔtR內(nèi)參物－ ΔtR待測(cè)成分，以考察 ΔtR的重復(fù)性。結(jié)果見表4。

表4 不同儀器及色譜柱測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中5 種成分的相對(duì)校正因子及保留時(shí)間差（以橙皮苷為內(nèi)參物）Tab.4 RCFs and retention time difference of Buzhong Yiqi Pills determined by different instruments and chromatographic columns （taking hesperidin as the internal reference）

2.6 QAMS 法與外標(biāo)法定量測(cè)定結(jié)果比較

取12 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，分別采用QAMS 法和外標(biāo)（ESM）法計(jì)算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨、阿魏酸、異阿魏酸的含量，對(duì)2 種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行成組 t 檢驗(yàn)，同時(shí)以相對(duì)誤差 ［ RE ＝（QAMS計(jì)算值－ESM實(shí)測(cè)值）／ESM實(shí)測(cè)值×100% ］對(duì) 2 種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較［16－18］，詳見表 5。結(jié)果顯示，各階段數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，組間 P 值均大于 0.05，同時(shí) 2 種方法測(cè)得含量的｜RE ｜均小于 5% ，表明2 種方法測(cè)得結(jié)果無顯著差異，QAMS 法用于補(bǔ)中益氣丸中6 種成分的含量測(cè)定可信度較好，可用于同時(shí)測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中多個(gè)組分的含量，可為全面評(píng)價(jià)補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

表5 QAMS 法與ESM 法測(cè)得補(bǔ)中益氣丸中6 種成分的含量比較（n ＝2）Tab.5 Comparison of the content of six components in Buzhong Yiqi Pills determined by QAMS and ESM（n ＝ 2）

3 討論

3.1 內(nèi)參物選擇

參考文獻(xiàn)［17－18］，橙皮苷價(jià)廉易得，且其出峰附近干擾成分少，容易辨認(rèn)，性質(zhì)穩(wěn)定。故以橙皮苷為內(nèi)參物，采用QAMS 法對(duì)其他指標(biāo)成分進(jìn)行定量測(cè)定。

3.2 色譜峰定位方法選擇

前期分別考察了 ΔtR、相對(duì)保留時(shí)間值和保留時(shí)間值用于待測(cè)色譜峰定位的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn) ΔtR在不同儀器和色譜柱條件下波動(dòng)較小。故選擇耐用性更強(qiáng)的ΔtR法作為色譜峰最終定位標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 色譜條件優(yōu)化

參考文獻(xiàn)［18－19］，采用光電二極管陣列檢測(cè)器在190 ～400 nm 波長范圍內(nèi)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，分別考察6 種待測(cè)成分的紫外吸收情況。結(jié)果顯示，于220 nm 波長處雜質(zhì)峰較少，但甘草酸銨的色譜峰吸收不明顯；于250 nm 波長處甘草苷和橙皮苷的色譜峰均有干擾；于285 nm 波長處毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜峰有干擾且橙皮苷的色譜峰拖尾嚴(yán)重；于270 nm 波長處各待測(cè)成分均有較強(qiáng)吸收且峰形和分離度均好。故確定含量測(cè)定波長為270 nm。

考察了不同有機(jī)相（乙腈和甲醇）與水相（水和磷酸溶液）的流動(dòng)相系統(tǒng)，并不斷調(diào)整有機(jī)相－水相（磷酸溶液）的比例。結(jié)果顯示，采用乙腈－0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各組分的色譜峰響應(yīng)最好且分離完全，基線平穩(wěn)，重復(fù)性較好，保留時(shí)間較穩(wěn)定。故最終確定流動(dòng)相為乙腈－0.1%磷酸水溶液。

3.4 方法評(píng)價(jià)

中藥成分復(fù)雜多樣，在進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)需進(jìn)行多組分測(cè)定，由于所需對(duì)照品數(shù)量眾多且大多費(fèi)用高昂，不利于廣泛應(yīng)用［20－22］。QAMS 法只需測(cè)定樣品中單一成分即可實(shí)現(xiàn)其他多種成分的同步測(cè)定，適用于中藥多組分的質(zhì)量評(píng)價(jià)。補(bǔ)中益氣丸中藥味較多、成分復(fù)雜，本試驗(yàn)選擇了毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸銨、阿魏酸、異阿魏酸、橙皮苷6 種具有代表性的指標(biāo)性成分進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，以橙皮苷為內(nèi)參物，不同品牌色譜儀和色譜柱對(duì)其余5 種成分的RCF 的影響較小，重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好，故建立了上述6 種指標(biāo)性成分含量測(cè)定的QAMS 法。該方法與ESM 法測(cè)得的含量無顯著差異，可在僅有1 個(gè)對(duì)照品時(shí)實(shí)現(xiàn)同步測(cè)定補(bǔ)中益氣丸中的多種指標(biāo)性成分，克服了對(duì)照品短缺及檢測(cè)成本高的困難，為補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制研究提供了參考。