口蹄疫滅活疫苗保存及穩定性研究

劉國民 高日明 尚策 宋慶慶 王凱 陳炳全 朱修澤/金宇保靈生物藥品有限公司 010030

口蹄疫滅活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S）是重要的免疫抗原，其含量、完整性、穩定性決定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是無囊膜病毒，對氯仿不敏感，對溫度、酸堿度比較敏感，當pH 變化或溫度升高時完整病毒146S容易分解。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果將大幅度降低。生產中如何保護146S 抗原完整性以及保證疫苗純度是工藝攻關難點。完整病毒粒子配合優質佐劑，刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞，進而保護易感動物不被口蹄疫病毒感染，最終使口蹄疫滅活疫苗起到防控疫病的作用。

疫苗生產是系統工程，包括細胞培養、病毒放大生產、純化濃縮、分裝乳化、保存、使用等工序。臨床使用時，合格的疫苗必須具備安全、高效、均一、穩定的特性。生產過程中采用合理的保存溫度和濃度，有助于延長病毒的保存期和維持較高的抗原水平，對生產中抗原的保存具有重要意義。本文通過對不同毒株熱穩定試驗、半成品不同溫度、濃度下146S 變化、同時通過成品疫苗保存期試驗及挑戰試驗等證明不同的口蹄疫毒株對溫度敏感性不同，半成品、產品疫苗對溫度、酸度比較敏感，2℃～8℃是疫苗最佳保存條件，本文章研究結果對疫苗穩定性方面研究有一定指導作用。

1 材料

1.1 口蹄疫毒株病毒液分別收集培養好的A/WH/09 毒株培養液、O/MYA98 毒株培養液、OR/80 毒株培養液及OZK/93 毒株培養液，各取1000mL 備用。

1.2 口蹄疫半成品原液及濃縮液A/WH/09、O/MYA98 口蹄疫滅活半成品抗原各1000mL，由金宇保靈公司生產部提供。

1.3 口蹄疫成品滅活疫苗OA 型口蹄疫滅活成品疫苗（20瓶）由金宇保靈公司生產部提供。

2 方法

2.1 不同口蹄疫毒株熱穩定性試驗將A/WH/09 毒株、O/MYA98 毒株、OR/80 毒株及OZK/93 毒株病毒樣品，先進行批量解凍，將毒液分裝成10mL 離心管12 只，將不同口蹄疫毒株在90℃熱水浴鍋中滅活1min～8min，檢測TCID50，并記錄數據，主要觀察口蹄疫毒株對溫度的敏感性。

2.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S 影響試驗隨機抽取本公司生產部滅活抗原液及其相應批號的10倍濃縮純化液，分別取樣進行初始樣品146S 含量的測定；將原液樣和10 倍濃縮后樣分別分裝，20mL/瓶，每種樣品分2 組，分別在-20℃和4℃冰箱中保存7 個月，每月定期各取出1 個樣品分別進行146S 的測定。

2.3 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗及反復凍融挑戰試驗將同批次的20 瓶OA 型口蹄疫滅活成品疫苗分成兩組，一組2℃～8℃保存12 個月，每月抽檢一瓶；另一組做-20℃挑戰試驗，保存8 瓶并反復凍融5 次，凍融后檢測抗原含量。

3 結果

3.1 不同口蹄疫毒株熱穩定性 從表1 數據可知，口蹄疫不同毒株對熱穩定性有差異

表1 90℃熱水浴對不同口蹄疫毒株穩定性試驗（TCID50）

3.2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下146S 影響從表2 數據可知，口蹄疫半成品在4℃和-20℃保存的7 個月中，完整病毒146S 粒子的含量均有所下降。4℃保存條件下，原液樣和濃后樣完整病毒146S 粒子的降解率分別為27.5%、12.3%；-20℃保存條件下，其降解率分別為87.5%、92.4%。從本試驗數據證明，4℃比-20℃保存條件更有利于抗原的保存，濃度對抗原保存影響不顯著。3.2 口蹄疫成品滅活疫苗保存期試驗及反復凍融挑戰試驗結果

表2 口蹄疫半成品在不同溫度和濃度條件下對完整病毒146S檢測結果（ug/mL）

從圖1 數據可知，口蹄疫 A 型、O 型滅活疫苗在2℃～8℃分別放置 12 個月，每月采用蔗糖密度梯度離心定量法檢測146S 含量，結果發現，146S 抗原含量基本沒有變化,說明疫苗有效抗原保存比較好，完整病毒粒子保存完整。

圖1 口蹄疫成品疫苗2℃～8℃保存12月146S 含量變化（μg/mL）

從圖2 數據可知，將口蹄疫滅活疫苗多次冷凍融化后，抗原含量降解比較多，每次反復凍融抗原損失10～20%左右，5 次反復凍融后，抗原損失50%左右，因此在保管疫苗時盡量不要凍融。凍融后的疫苗堅決不能使用，因為完整病毒粒子146S 已經裂解為無效的12S 五聚體。

圖2 口蹄疫O 型、A 型滅活疫苗反復凍融后146S 抗原含量變化（μg/mL）

圖3 口蹄疫衣殼蛋白在存儲、加熱、低pH 條件下，完整病毒粒子146S 裂解成12S 五聚體電鏡圖

4 討論

穩定的抗原、有效的佐劑是疫苗研究的重點和難點。滅活疫苗在長期儲存、加熱和微酸性環境中，病毒顆粒極其容易裂解，裂解產物也被稱為12S，12S 是一個由VP1，VP2，VP3組成的五聚體。因為五聚體之間存在大量的組氨酸殘基，在酸性環境下組氨酸會迅速發生質子化，釋放正電荷，通過靜電排斥作用引發粒子裂解，這是口蹄疫不穩定的原因。由于146S 粒子在酸性環境下分解成12S 粒子，而12S 表面的免疫反應位點被隱藏或發生形變的緣故，使12S 不具備任何免疫原性，無法激發產生抗體，降低口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒會在高溫狀態下，使組合狀態的 12S 粒子轉化為分解狀態，因此口蹄疫病毒不宜長期暴露在高溫狀態下，口蹄疫疫苗效力與口蹄疫滅活疫苗中的 146S 粒子數量有關，若是能夠確保 146S 粒子穩定不被分解，口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保護，這也是口蹄疫滅活疫苗2℃～8℃保存的機理。口蹄疫抗原穩定性差給口蹄疫疫苗的生產、儲存和應用帶來了很多困難，使用過程中必須全程冷鏈運輸以保護口蹄疫的免疫原性。

口蹄疫病毒抗原對酸和熱極其敏感，為了保證疫苗質量，生產商采取研發疫苗抗原保護劑、增加昂貴的冷鏈運輸系統、將優質疫苗送到用戶手中。如何保障疫苗抗原不降解或降解速率慢，是疫苗生產企業的難點，但金宇生物一直采用自主研發的UTM 保護劑，從工藝技術上保障疫苗穩定性，從運輸環節上采用無死角的2℃～8℃冷鏈運輸，使客戶用上最好、最新鮮的疫苗。不論后續技術如何革新，口蹄疫病毒粒子的完整性和穩定性研究，一直是廣大科技從業者長期努力和研究的方向。