4種抗菌洗液對金黃色葡萄球菌的抑制作用*

黃少隆，張翠惠，黃冬枚，郭文婷，鄭慶茹，周 湧

廣東省東莞市濱海灣中心醫院檢驗科，廣東東莞 523903

近年來，金黃色葡萄球菌的臨床檢出率逐年增加，在球菌檢出率中居第一位[1]。作為一種可導致人畜共患病的條件致病菌，其可通過分泌不同的毒力因子引發各類感染[2-3]。當人體免疫力下降時，金黃色葡萄球菌更易引發人體各組織器官的化膿性炎癥，嚴重者甚至會引起心內膜炎、腦膜炎以及敗血癥等致死性疾病[4-6]。另一方面，金黃色葡萄球菌極易定殖于女性生殖道內，是近年來女性細菌性陰道炎、盆腔炎發病率升高的主要原因，并且對處于妊娠期的女性患者而言，金黃色葡萄球菌的感染甚至會導致新生兒早產以及妊娠流產[7]。目前，耐藥金黃色葡萄球菌廣泛存在，對感染的患者而言，除正確運用抗菌藥物外，對患處進行正確的消毒及有效的沖洗也起著十分重要的作用，因此，進一步探討當前市面上常見的抗菌洗液對金黃色葡萄球菌的抑制作用具有重要意義[8-9]。本課題組選取了4種不同抗菌機制的洗液進行研究，旨在為臨床后期應用提供參考。

1 資料與方法

1.1試驗菌株 金黃色葡萄球菌ATCC43300。

1.2試劑與儀器 4種洗液均購于廣東省東莞國藥集團有限公司，其主要成分如下：A是由納米銀顆粒為主要成分組成的抗菌洗液；B是由苦參、冰片、黃柏為主要成分組成的中藥制劑；C是以葡萄柚種子為基本原料所提取的一種新型植物抗菌劑；D是由蛇床子、蒼術、薄荷、苦參以及金銀花為主要成分組成的中藥制劑。腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒(ELISA)購于康朗生物科技有限公司；單核巨噬細胞系購于美國模式培養物研究所；RPMI-1640培養基購于普賽諾生命科技有限公司；VITEX比濁儀購自法國生物梅里埃公司；酶標儀購于普朗公司；電子天平購自衡平儀器儀表有限公司；紫外分光光度計購自普美達公司。

1.3方法

1.3.1不同抗菌洗液對金黃色葡萄球菌生長的影響 采用美國臨床實驗室標準協會(CLSI)推薦的肉湯微量稀釋法，將A、B、C、D抗菌洗液按梯度稀釋后，分別添加到無菌的96孔板中，其中第1孔至第11孔分別加入稀釋好的不同濃度的抗菌洗液10 μL，第12孔加入等量的滅菌水作為陰性對照。4種抗菌洗液第1孔到第11孔各藥物濃度分別為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.20、3.10、1.50、0.75、0.37、0.18 mg/mL。將金黃色葡萄球菌培養復蘇，并放培養箱中培養18 h至對數生長期，通過麥氏比濁法定量，制備濃度為1.5×108CFU/mL的菌懸液，即0.5麥氏濁度。用MH肉湯稀釋1 000倍后，每孔中加入100 μL菌懸液，蓋上蓋子后在培養箱中培養24 h后判斷結果，同時測定每孔菌液600 nm處吸光度(A600)值。以首先出現完全抑制金黃色葡萄球菌生長的小孔藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。用含有0.5及1倍MIC的抗菌洗液的培養基培養金黃色葡萄球菌24 h，分別于0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、24.0 h取對應菌液10 μL涂布于MH平板，以孵育時間為橫坐標，以菌落數為縱坐標繪制抑菌曲線。

1.3.2金黃色葡萄球菌在不同抗菌洗液作用后對紫外吸收物質滲透量檢測 用含有0.5以及1倍MIC的抗菌洗液的培養基培養金黃色葡萄球菌，在菌液與藥液混合后，金黃色葡萄球菌的終濃度為1.5×105CFU/mL，抗菌洗液終濃度分別為0.5以及1倍MIC。分別于0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后取相應菌液5 000 r/min下離心15 min，再經0.2 μm的濾膜過濾上清液后在260 nm下測定懸浮液吸光度(A260)值，以純凈水替代抗菌洗液作用后的菌體懸浮液作空白對照。時間為橫坐標，以A260值為縱坐標繪制曲線。

1.3.3TNF-α的檢測 將人單核細胞THP-1細胞放置于RPMI-1640培養基中在37 ℃，5%CO2環境下培養，按規定時間更換培養液。誘導分化THP-1細胞后加入事先配制好濃度的A、B、C、D抗菌洗液預處理2 h，棄掉上清液后分別向其中加入2×106CFU/mL金黃色葡萄球菌的菌懸液，刺激12 h后，以5 000 r/min的轉速離心以收集細胞培養液，隨后使用TNF-α檢測試劑盒(ELISA)測定TNF-α水平。將不受抗菌洗液與金黃色葡萄球作用的THP-1細胞設置為空白對照組E。將只受金黃色葡萄球菌作用的THP-1細胞設置為陰性對照組SA。

2 結 果

2.1不同抗菌洗液處理后金黃色葡萄球菌的MIC B、D洗液的MIC為第6孔，即MIC=6.20 mg/mL。A、C的MIC為第7個孔，即MIC=3.10 mg/mL。不同抗菌洗液處理后的金黃色葡萄球菌的A260值見表1。1倍MIC與0.5倍MIC下的抑菌曲線見圖1、2。

表1 不同濃度抗菌洗液處理后的金黃色葡萄球菌的A600值

圖1 金黃色葡萄球菌在1倍MIC下的抑菌曲線

圖2 金黃色葡萄球菌在0.5倍MIC下的抑菌曲線

2.2金黃色葡萄球菌在不同抗菌洗液作用后的A260檢測結果 結果顯示，4種抗菌洗液對金黃色葡萄球菌作用后，其A260值與抗菌洗液的濃度成正比，濃度越高，A260值越高。見圖3、4。

圖3 1倍MIC下金黃色葡萄球菌的A260值

圖4 0.5倍MIC下金黃色葡萄球菌的A260值

2.3不同抗菌洗液作用THP-1細胞后分泌TNF-α水平的比較 不同抗菌洗液作用THP-1細胞后均產生抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴關系，抑制效果分別為A>C>B>D，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5、6。

圖5 1倍MIC下對金黃色葡萄球菌刺激后THP-1細胞分泌TNF-α水平

圖6 0.5倍MIC對金黃色葡萄球菌刺激后THP-1細胞分泌TNF-α水平

3 討 論

本研究通過分析4種抗菌洗液對金黃色葡萄球菌生長、細胞質膜完整性和刺激TNF-α分泌3個方面的影響作用，證實了這4種抗菌洗液對金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌效果。其中，A與C洗液抑菌效果優于另外兩種，MIC為3.10 mg/mL，主要原因為抗菌機制不同。

A洗液是一類新型抗菌劑，通過納米銀顆粒直接進入菌體內部，通過與代謝蛋白酶結合，使菌體窒息死亡，具有抑菌殺菌作用強大、抗耐藥性及作用持久等優點，具有傳統無機抗菌劑無法比擬的抗菌效果[10]。但是，此類洗液對使用及保存要求較高，金屬銀過敏者禁用，且切勿入口，需存放于避光、干燥、通風處，以免失效。C洗液主要為葡萄柚種子提取物，是一種高效無毒的抗菌劑，近年來已廣泛應用于各種污染手術的沖洗中，可有效預防術后感染。有研究表明，葡萄柚種子提取物還具有調節菌群生態平衡，調節女性陰道內酸堿度平衡的功效，其主要通過促進女性陰道內活性氧的吸收，調節陰道內細菌的增殖，進而實現消炎滅菌的目的[11]。目前市面上此類抗菌洗液的品牌比較少，還未被大眾廣泛應用。B配方中主要含苦參、冰片、黃柏等中藥成分，性質溫和，常用于會陰部位的日常清潔。同時還具有活血化瘀、減輕傷口疼痛感以及促進傷口恢復等特點[12]，可用于女性會陰傷口護理。D洗液主要由蛇床子、蒼術、薄荷、苦參以及金銀花等成分組成，主治女性濕熱帶下，如陰部瘙癢紅腫，白帶量多，色黃或如豆渣狀，口苦口干，尿黃便結，對于霉菌性、滴蟲性陰道炎有清熱燥濕以及止癢的效果，更適合女性婦科炎癥常規使用[13-14]。

金黃色葡萄球菌生存及感染均基于菌體的完整性，在自然環境中，細胞壁及細胞質膜可以阻擋內容物的泄漏同時吸取養分，形成一個特殊的生物屏障，既保障了滲透壓的穩定也在一定程度上阻擋外界有害因素的侵擾，是極為重要的組成部分。當屏障受損時，細胞內容物才會發生泄漏，最初是相對分子質量比較小的一些無機鹽和微量元素，其次是一些大分子，如蛋白質及核酸。在260 nm處，B及D洗液的A值明顯低于其他兩種洗液，說明其對金黃色葡萄球菌細胞膜的破壞作用較小，這可能由于中藥復方類型的洗液性質溫和，沒有直接作用破壞細胞膜的靶點。

4類抗菌洗液均可抑制TNF-α水平的分泌且與濃度相關，A洗液抑制效果最好，而D最差。這可能與納米銀顆粒相對分子質量較小可以更快進入細菌內，與相關的酶結合使其失活有關。C作用僅次于A洗液，可能與C的主要成分也是小分子物質，比其他兩種藥物更易滲入細胞有關。

同時，本研究發現D洗液的抑菌效果較差，其他3種洗液按照抑菌效果從高到低分別為A>C>B。但是，A洗液價格較為昂貴，使用及保存要求高，所以在生活中未能廣泛使用。同時，本研究證明C洗液也具有良好的抗菌效果，價格適中，但國內商品化的產品較少，選擇性低，不為大眾所熟知，可在人們日常生活中推廣使用。中藥配伍洗液因殺菌譜較廣以及可減少細胞耐藥性等優勢，近年來已被廣泛應用。沈煒等[15]研究發現中藥“婦洗液”治療育齡期女性陰道炎的療效顯著，且療效明顯優于克癢舒洗液。

本研究亦存在一些不足。首先，金黃色葡萄球菌毒力因子的調控機制非常復雜，本試驗雖研究4種抗菌洗液對抑制TNF-α水平的影響，但卻并未探討其對金黃色葡萄球菌的基因表達及彼此之間的關系及具體影響機制，后期有待進一步研究。