籬欄網多糖的提取工藝優化及抗氧化活性

陳淑芳，黎慶濤，黃凱，鄔智高，張文清，張良軍

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.廣西工業職業技術學院 醫藥健康學院，廣西 南寧 530004)

籬欄網[Merremiahederacea(Burm.f.)Hall.f.]為旋花科魚黃草屬植物,近年來研究人員發現籬欄網中可能含有多糖、苷類、黃酮等化學成分，具有抑菌[1]、消炎[2]、提高機體吞噬細胞數量[3]等作用。目前，多見對籬欄網粗提取物生物活性的研究，其有效活性成分還并不明確。

現已有大量研究報道多糖具有抗氧化[4]、抗衰老[5]、免疫調節[6]等一系列重要的生物活性，多糖已經被廣泛用于食品、醫藥、農業和化妝品工業中。

本文對籬欄網多糖的熱水浸提工藝進行優化，并測定其對兩種自由基的清除能力，為后續天然抗氧化劑的開發及籬欄網的綜合利用奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

籬欄網采集于廣西南寧，由廣西衛生職業技術學院鐘珍副教授鑒定為籬欄網[Merremiahederacea(Burm.f.)Hall.f.]的全草；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、濃硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、L(+)-抗壞血酸等均為分析純。

HH-S26恒溫水浴鍋；SHZ-Ⅲ循環水式多用真空泵；RE-2010旋轉蒸發器；TU-1950分光光度計。

1.2 籬欄網多糖的提取

籬欄網，清洗除雜，烘干，粉碎過60目篩。乙醇預處理，烘干。熱水浸提，液料比25 mL/g，提取溫度90 ℃，提取時間3.5 h，提取次數2次。收集上清液，抽濾，旋蒸，醇沉過夜。收集沉淀，凍干，沉淀復溶，得籬欄網粗多糖水溶液，采用分光光度計測定多糖含量，計算籬欄網多糖得率(Y)。

Y=[(c標曲對應濃度·V多糖溶液)/M原料質量]×100%

(1)

1.3 葡萄糖標準曲線的繪制[7]

葡萄糖濃度與吸光度值的標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.4 籬欄網多糖的抗氧化作用

1.4.1 清除DPPH 自由基能力的測定 清除 DPPH自由基能力的測定按照參考文獻[4]的方法，由公式(2)計算：

Y=[(A0-A樣品+A樣品空白)/A0]×100%

(2)

1.4.2 清除羥自由基能力的測定 清除羥自由基能力的測定按照參考文獻[4]的方法，由公式(3)計算。

Y=[(A0-A樣品+A樣品空白)/A0]×100%

(3)

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

每組測定3次。

2.1.1 提取次數對籬欄網多糖得率的影響 提取次數的影響見圖2。

圖2 提取次數對籬欄網多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction times on yield of Merremiahederacea polysaccharides

由圖2可知，籬欄網多糖得率隨著提取次數的增加而增加，可能是因為多糖提取存在溶出平衡，加入新鮮的溶劑會重新建立平衡，促使更多多糖溶出，提取次數為2次時，籬欄網多糖已基本提取完畢，所以第3次提取時沒有更多多糖溶出。確定提取次數為2次。

2.1.2 液料比對籬欄網多糖得率的影響 液料比的影響見圖3。

圖3 液料比對籬欄網多糖得率的影響Fig.3 Effects of ratio of liquid to material on yield ofMerremia hederacea polysaccharides

由圖3可知，籬欄網多糖得率隨著液料比的增加呈現先升高后下降的趨勢，液料比為25 mL/g時，籬欄網得率最大。這可能是由于隨著液料比增大，籬欄網植物細胞與水之間的濃度差異大，有利于多糖溶出，但液料比過大可能會降低分子之間的相互作用，還會導致籬欄網中部分水溶性雜質溶出，干擾多糖溶出效果。選擇液料比為25 mL/g。

2.1.3 溫度對籬欄網多糖得率的影響 提取溫度的影響見圖4。

圖4 溫度對籬欄網多糖得率的影響Fig.4 Effects of temperature on yield of Merremiahederacea polysaccharides

由圖4可知，籬欄網多糖得率隨著溫度的升高先增加后降低，90 ℃時達最高。可能是溫度增加，改善了籬欄網多糖的溶解性，100 ℃時，得率略有下降，可能是籬欄網多糖的碳鏈對熱降解敏感，多糖發生變性降解，降低了提取過程中靶向回收率。考慮到溫度越高，能耗越高，選擇提取溫度為90 ℃。

2.1.4 提取時間對籬欄網多糖得率的影響 提取時間的影響見圖5。

由圖5可知，籬欄網多糖得率隨時間的變化規律基本符合菲克第二定律：在一定時間后，固體基質和萃取溶液中的溶質濃度會達到平衡。提取時間到達3.5 h時，多糖得率已趨于穩定，再增加反應時間對多糖得率影響不大。提取時間選擇3.5 h。

圖5 提取時間對籬欄網多糖得率的影響Fig.5 Effects of extraction time on yield of Merremiahederacea polysaccharides

2.2 響應面優化實驗

2.2.1 響應面實驗結果 選擇液料比、溫度和提取時間為自變量，通過響應面實驗優化籬欄網多糖的提取工藝，因素水平見表1，結果見表2。

表1 響應曲面因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface

表2 響應面實驗結果Table 2 Experimental design and results forresponse surface analysis

用Design-Expert8.0.6軟件對表2數據進行擬合，得到籬欄網多糖得率(Y)對液料比(A)、溫度(B)和提取時間(C)的回歸模型Y=4.31+0.15A+0.31B+0.25C-0.083AB+0.017AC-0.18BC-0.39A2-0.25B2-0.21C2，方差分析結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3可知，回歸模型的P值<0.000 1，差異顯著。失擬項的值為0.415 6，高于0.05，相對于純誤差而言不顯著。說明該模型可以用來分析籬欄網多糖的提取工藝。

2.2.2 響應面交互作用分析 使用Design-Expert8.0.6軟件繪制響應值與不同影響因子間的響應面及等高線圖，見圖6(a～c)。

由圖6a可知，在料液比20～30 mL/g的范圍內，隨溫度從80 ℃增加到95 ℃左右，多糖得率增加，而后隨溫度從95 ℃增加至100 ℃，多糖得率變化不大。由圖6b可知，溫度為80～100 ℃時，隨提取時間由3 h升至4 h，多糖得率增加，在4 h后多糖提取達平衡，得率變化不大。由圖6c可知，在提取時間在3～4 h范圍內時，多糖得率隨料液比增大先升高后降低。

圖6 各因素交互作用對籬欄網多糖得率的響應面及等高線圖Fig.6 Response surface diagrams and contour diagrams of the interactive effects of variousfactors on the yield of Merremia hederacea polysaccharides

據報道[8]，溶解率是提取過程中的限速步驟，提取溫度對多糖的溶解率具有重要影響。因此，溫度是熱水提取法提取籬欄網多糖的關鍵因素。通常熱水提取法提取植物多糖的最適溫度在90 ℃左右，不同文獻中報道的溫度范圍略有不同，具體取決于提取物和提取的方法。

回歸方程預測籬欄網多糖最佳提取工藝條件為：液料比25.59 mL/g，溫度 94.5 ℃，提取時間 3.6 h，最大籬欄網多糖得率為 4.39%。

2.2.3 驗證實驗 為便于實際操作，將最佳條件簡化為：液料比26 mL/g，溫度94.5 ℃，提取時間 3.6 h，在該條件下提取2次，實際籬欄網多糖得率為(4.38±0.04)%，與預測值4.39%相近。因此，該模型預測的籬欄網多糖提取工藝參數是可行的。

2.3 抗氧化能力分析

多糖的抗氧化性歸因于多糖鏈上的電子供體或氫供體官能團，可以通過進行體外抗氧化劑測定。

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基具有不成對的電子，呈紫色，當其遇到自由基清除劑后會被還原而轉變為黃色。由圖7可知，籬欄網多糖清除DPPH自由基的IC50為(0.12±0.03)mg/mL。

圖7 籬欄網多糖對DPPH自由基清除能力Fig.7 Scavenging ability of Merremia hederaceapolysaccharides to DPPH free radical

2.3.2 羥自由基清除能力 羥自由基是自然界危害最大的反應性自由基之一，它可以與細胞中幾乎所有的生物大分子發生反應，清除該自由基對于預防氧化損傷至關重要。由圖8可知，籬欄網多糖對羥自由基的清除率與抗壞血酸相近，其IC50值為 (1.21±0.02)mg/mL。

圖8 籬欄網多糖對羥自由基清除能力Fig.8 Scavening ability of Merremia hederaceapolysaccharides to hydroxy free radical

3 結論

采用熱水浸提法提取籬欄網多糖最佳工藝參數為：液料比26 mL/g，溫度94.5 ℃，提取時間3.6 h。在此條件下，籬欄網多糖得率為(4.38±0.04)%。該多糖具有較好的抗氧化能力，可用于食品，藥物和醫學應用。