N和O雙同位素技術解析厭氧氨氧化分餾效應的研究進展

陳翠忠，孫志華，王健康，額熱艾汗，李俊峰，吳心蓉，劉生寶，杜可清

(石河子大學 水利建筑工程學院，新疆 石河子 832000)

近年來隨著污水處理技術的不斷發展，新型生物脫氮技術——厭氧氨氧化將很好地克服傳統脫氮過程中曝氣能耗高、有機碳源不足、產生溫室氣體及污泥產量高等缺點[1-2]，同時能夠實現污水廠能源中和甚至能量回收[3]。Strous等[4]通過化學計量和物料衡算推導出厭氧氨氧化反應方程式為：

+2.03H2O (1)

現階段厭氧氨氧化菌的發現呈現多樣化，菌種之間也存在差異性，菌種間的N和O遷移轉化過程由于功能微生物的作用，產生的分餾效應也會呈現明顯的不同，定性定量問題成為關鍵，針對于低含量的海洋氮素及地下水氮素已經不再制約質譜儀測定，而對于實際脫氮系統來說相對還較少，了解新型工藝的同位素特性可以揭示反應機理、詮釋反應體系，為長期穩定運行提供可行性分析。

1 同位素轉化及分析

1.1 溶解態三氮轉化法

同位素質譜儀只能接受N2O、N2及CO2等簡單氣體進行測定，因此在進行同位素測定前均需要將溶解態物質轉化為氣態物質，以此來滿足測定的要求。

表1 氮素轉化方法對比Table 1 The comparison of nitrogen transformation methods

圖1 氨氮轉化過程Fig.1 The process of ammonia nitrogen conversion

圖2 細菌反硝化測定同位素比值Fig.2 The isotope ratio of denitrification by bacteria

這種方法在測定過程中同時可以實現氮和氧雙同位素的檢測，通過動力學模型分析即可實現數據的準確分析。通過標準品校正可以了解到同位素分餾、同位素交換校正，標準品校正過程中發現，測定結合和給定值吻合度很好，可以作為轉化的方法進行數據分析。采用細菌反硝化的方法大大節省了成本及運行時間，而且可以避免氮素之間的交叉污染。但培養細菌過程可能成為限制方法應用的前提條件，不僅要進行菌種的恢復和培養，而且還要保證菌種不被污染，大大限制了方法的靈活性。

圖3 硝氮轉化途徑Fig.3 Nitrate transformation pathway

1.2 同位素解析

在厭氧氨氧化反應過程中，氮和氧同時參與反應，隨著環境因素的變化，同位素豐度會呈現差異性，隨著反應地進行，底物和產物含量發生改變，同時也促進了同位素的遷移轉化，通過動力學模型實現反應過程機理探究及氮素循環解析。同位素分析常常采用傳統的delta(δ) notion進行樣品輕重同位素分析：δ15N vs air {δ15N=([15N/14N]sample/[15N/14N]air-1)×1 000，其中15R =15N/14N，空氣是標準大氣N2}[5，22]和δ18O vs VSMOW{δ18O=([18O/16O]sample/[18O/16O]VSMOW-1)×1 000，其中18R=18O/16O，VSMOW是指標準的維也納標準海洋平均水含量}[23-24]。在此基礎上還有稍有不同的表達方式[25-26]：

δ15N={[15N/(15N+14N)sample]/

[15N/(15N+14N)standard]-1}×1 000 (2)

δ18O={[18O /(18O+16O)sample]/

[18O /(18O+16O)standard]-1}×1 000 (3)

通過對比發現兩種計算模式僅相差0.25%，兩種定義方式可以看作是等價的。

反應過程中同位素的分餾效應隨著反應的進行呈現差異性變化，而反應底物是否不斷補給或不同來源的混合同樣也會引起分餾效應的變化，常常被分為封閉系統和開放性系統。

1.2.1 封閉性系統分析 封閉系統方法是一次性投加，之后不與環境進行物質交換的孤立系統，即不發生氣體損失，不進行含氮物質的交換及損失，這種封閉系統中分析同位素分餾過程的方法是由Mariotti等[27]分析所得：

αp/s=Rpi/Rs=(d15Ns/15Ns)/(d14Ns/14Ns)

(4)

αp/sln(14Ns/14Ns，0)= ln(15Ns/15Ns，0)

(5)

其中，Rpi，Rs表示產物和剩余底物同位素比率，αp/s表示同位素分餾因子，14Ns/14Ns，0表示反應過程中和起始輕同位素比值，15Ns/15Ns，0表示反應過程中和起始重同位素比值。同時可以得出f=Ns/Ns，0≈14Ns/14Ns，0，由于在自然系統中，15N豐度在0.366 3原子百分比(0.366 3± 0.018 3)附近變化很小，所以14N≈15N+14N的近似是有效的，由此推導出經典“瑞利”方程：

δs-δs，0=εlnf

(6)

δp=δs，0-ε×flnf/(1-f)

(7)

1.2.2 開放性系統分析 開放性系統即在反應過程中不斷添加底物，充分滿足微生物的底物要求，形成恒定同位素組成反應底物池，少量的底物會隨著反應產物一同流出反應器來進行同位素比值數據的分析[28]，保證充足的底物濃度，進行非底物限制的培養。公式計算如下所示：

f×Rs+(1-f)Rp=Rs，0

(8)

Rp=Rs，0(1-fαp/s)/(1-f)

(9)

δs≈δs，0-ε(1-f)

(10)

δp≈δs，0+f×ε

(11)

2 同位素解析厭氧氨氧化機理

新型厭氧氨氧化工藝作為現階段污水處理脫氮主要的貢獻者，由于其獨特的優勢已經從測流轉為主流工藝的應用，組合工藝能夠實現長期穩定運行厭氧氨氧化成為主要的貢獻者，可以彌補實際水廠碳源不足、基建費用高、污泥產量大等弊端，促進厭氧氨氧化長期穩定運行，了解反應機理成為關鍵。在底物氨氮和亞硝轉化過程中，不僅轉化為氮氣，同時還有硝氮的生成，這就促進了氮和氧元素直接參與反應體系，了解反應過程中氮和氧同位素分餾效應對于同位素解析反應過程起到關鍵作用。結合硝化階段N和O雙同位素分析方法，了解厭氧氨氧化菌反應機理及N和O同位素效應分析見圖4。

圖4 厭氧氨氧化過程中同位素效應Fig.4 Isotope effect in anammox processA.氮同位素效應；B.氧同位素效應

現階段關于分析厭氧氨氧化在反應過程中同位素遷移轉化引起的同位素效應研究相對較少，對厭氧氨氧化同位素參數進行整理收集見表2。

表2 厭氧氨氧化同位素參數Table 2 The isotopic parameters of anammox

同時有研究也發現，由于氨氧化菌屬分布較廣，不同菌屬在系統發育上存在差異，可能具有不同的酶(如亞硝酸鹽還原酶)，其代謝途徑也不同，從而誘導的同位素效應存在差異，對于N同位素效應呈現：15εNH+4→N2維持在(30.9±0.2)‰～(32.7±0.7)‰，15εNO-2→N2不同菌之間差值較明顯，Ca.S.japonica和Ca.K.stuttgartiensis相對較接近分別為(19.9±1.7)‰和(16.0±4.5)‰[35]，而對于15εNO-2→NO-3表現出強烈的逆動力學同位素效應(15εNO-2→NO-3<0)[36]，也會存在亞硝和硝氮之間氮同位素交替或置換過程(如圖4)，通常將同位素變化過程和硝化或反硝化結合起來進行分析，了解反應過程的差異性。動力學模型結合同位素測定數據才能更好地了解反應過程中參數變化，對于厭氧氨氧化底物和產物轉化過程中，其分析過程如下所示。

銨同位素分餾進行數據分析常采用的計算公式：

-ln(R15NNH+4)=15εNH+4→N2×ln(fNH+4)

(12)

ln(R15NNH+4)=ln[(δ15NNH+4(t)+1 000‰)/

(δ15NNH+4(t0)+1 000‰)] (13)

ln(fNH+4)=ln[NNH+4(t)/NNH+4(t0)]

(14)

NOX同位素分餾：

(15)

(16)

δN2(t+Δt)×N2(t+Δt)=δN2(t)×N2(t)+

(17)

其中，N2(t)和N2(t+Δt) 表示t和t+Δt時刻N2濃度，δN2(t)和δN2(t+Δt)表示t和t+Δt時刻N2同位素比值。在厭氧氨氧化氮素轉化過程中，氮素的轉化促進了同位素動力學參數的變化，并結合上述公式進行分餾效應分析。

3 結論及展望

厭氧氨氧化作為新型主流脫氮工藝已成功應用于廢水處理，充分了解氮素轉化機理及反應體系實際參與反應的物質對于指導工藝運行起到至關重要的作用。在已有方法的基礎上總結氮素轉化方式，化學轉化成為水體研究厭氧氨氧化脫氮性能氮素轉化過程最可靠的方式，結合動力學模型了解厭氧氨氧化氮和氧同位素效應。N和O雙同位素技術可以明確厭氧氨氧化主流工藝過程中參與反應的電子供體及實際參與反應的物質，了解脫氮過程動力學和熱力學效應，實現脫氮過程元素遷移轉化的定量及定性分析，但僅依靠同位素分析是不完善的，建議今后的研究領域如下：

(1)在城市污水處理中，常常同時存在多個反應共同作用，硝化、反硝化、厭氧氨氧化或自養/異養反硝化共存等，反應體系中產物由多個反應共同參與，使得系統復雜多變，那么將數學模型的研究可能成為解決負荷系統的有效途徑。

(2)微生物多樣性決定了總氮損失路徑的多樣性，特殊功能菌共同作用形成了不同的脫氮途徑。但在實際工藝中，由于進水基質的復雜性和多數脫氮功能微生物的不可分離培養特性，缺少原位水平的活性細菌群落的調查。基于DNA的穩定同位素探針技術(DNA-SIP)是一種原位連接活性微生物群落和特殊生態功能的有力工具，建議采用探針技術同步進行微生物群落結構分析。

(3)N和P是城市污水處理過程主要的對象，常常將脫氮作為主方向，化學法除磷的采用使得P的遷移變化常常被忽略，同時進行N和P的同步分析可能能夠更好地分析污染物的去除關系。