對稱性中位取代羥基卟啉熒光檢測水體痕量汞離子研究

呂向菲，陳瑞華，趙永國，陳靜，張瀠心，白天瑜

(1.長安大學(xué) 水利與環(huán)境學(xué)院，陜西 西安 710054；2.中交第一勘察設(shè)計研究院有限公司，陜西 西安 710075；3.西安中交環(huán)境工程有限公司，陜西 西安 710065)

《關(guān)于汞的水俁公約》預(yù)示我國將進一步加強對水體中汞污染的治理[1-2]。《“十三五”生態(tài)環(huán)境保護規(guī)劃》也將水體中的汞污染作為重點治理對象，加強水體汞離子的檢測具有重要意義[3-4]。卟啉分子因具有良好的熒光發(fā)射特性，對光穩(wěn)定、量子產(chǎn)率高、Stokes位移大，可作為高靈敏汞離子熒光探針[5-7]。研究擬選用具有對稱性結(jié)構(gòu)的羥基中位取代卟啉，借助其卟啉環(huán)的配位作用和環(huán)外中位取代的羥基與汞離子相互作用，實現(xiàn)對水體痕量汞離子的熒光檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

4-羥基苯甲醛、苯甲醛、吡咯、丙酸、無水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、氯化汞、無水硫酸鈉均為分析純，吡咯使用前需重新蒸餾提純。

RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；S220-F 臺式酸度計；島津Shimadzu UV1800紫外-可見光譜儀；BEQ UZNDX550-FTIR紅外光譜儀；MALDI-TOF飛行質(zhì)譜儀；FP-550熒光光譜儀。

1.2 兩種對稱性羥基卟啉的合成與純化

使用改進的丙酸合成法合成兩種具有對稱結(jié)構(gòu)的中位取代羥基卟啉[8]。5，15-二-(4-羥基苯基)10，20-二苯基卟啉(P2OH)和5，10，15，20-四-(4-羥基苯基)苯基卟啉(P4OH)，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 兩種羥基卟啉的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structures of P2OH and P4OH

以H2P2-OH羥基卟啉合成為例，合成步驟如下：將100 mL丙酸加入250 mL三頸瓶中，再分別加入2.3 g的對羥基苯甲醛和5.7 mL苯甲醛，加熱攪拌，使二者充分溶解，混合。繼續(xù)升溫至丙酸回流。緩慢滴入5.3 mL新蒸吡咯，待溶液變?yōu)樽睾谏?，用錫紙包裹反應(yīng)瓶，并繼續(xù)維持丙酸回流狀態(tài)，反應(yīng)1.5 h后停止，撤去加熱攪拌裝置，靜置冷卻至室溫。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸去大部分的丙酸。加入100 mL無水乙醇。將三頸瓶置于冰箱冷藏室，靜置過夜，次日減壓抽濾，用無水乙醇洗滌產(chǎn)物至濾液無色。70 ℃下真空干燥4 h，得1.56 g紫黑色固體。將紫黑色固體溶解，以二氯甲烷和正己烷體積比 4∶6 作為淋洗劑，進行硅膠柱層析分離，收集第三譜帶即為P2OH。

P4OH的合成，需調(diào)整4-羥基苯甲醛和吡咯反應(yīng)量為等摩爾比，合成步驟與P2OH的步驟類似，最終固體產(chǎn)物以二氯甲烷作為淋洗劑，收集第六譜帶。

1.3 兩種對稱中位取代羥基卟啉熒光檢測水體Hg2+

1.3.1 溶液的配制 取0.016 2 g P2OH和0.017 0 g P4OH分別溶解于30 mL CH3Cl3中，以乙醇作為稀釋劑，定容于250 mL的容量瓶中，分別得到 0.1 mmol/L P2OH和0.1 mmol/L P4OH的儲備液，避光冷藏、備用。

配制10 mmol/L的HgCl2溶液，作為Hg2+的儲備液，冷藏備用。

用乙醇和水體積比1∶1的混合溶劑配制醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=6)。

1.3.2 熒光光譜儀的測試條件 因pH值對檢測體系有較大影響，本研究所有檢測溶液，如無特殊說明，均使用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作為溶劑，定容于10 mL容量瓶中。測試過程中，如無特殊說明，羥基卟啉的濃度均為0.01 mmol/L。在探針的選擇性測試過程中，所有檢測溶液中 Hg2+濃度均為 0.02 mmol/L。為保證檢測效果，所有溶液配制完成后，均需在2 h內(nèi)進行測試。設(shè)定427 nm為熒光激發(fā)波長，在550～700 nm的發(fā)射波長范圍內(nèi)采集體系熒光光譜。在此條件下，分別比較兩種檢測體系的選擇性、時間穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 P2OH和P4OH的合成分析

P2OH和P4OH的合成均選取反應(yīng)時間短、產(chǎn)率較高的Alder丙酸法，此方法用于合成羥基卟啉，反應(yīng)簡單、易控制、產(chǎn)率較高。反應(yīng)完成后，要蒸去至少2/3的丙酸，防止卟啉酸化形成二氫卟啉，分離提純。通過對兩種卟啉進行質(zhì)譜分析，正離子模式下，顯示較強的[M+H]+峰(見表1)[8-9]，證明卟啉合成成功。分別測試0.1 mmol/L P2OH和P4OH乙醇溶液的紫外-可見吸收光譜(見圖2)，P2OH和P4OH的S帶峰分別位于416 nm和418 nm左右，Q帶在450～700 nm范圍內(nèi)有4個峰，這些也作為羥基卟啉的佐證。

表1 兩種對稱中位取代羥基卟啉的[M+1]峰Table 1 [M+1] peaks of two symmetricallysubstituted hydroxyporphyrins

圖2 P2OH和P4OH的紫外可見光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of P2OH and P4OH

2.2 兩種對稱中位取代羥基卟啉檢測水體Hg2+

2.2.1 兩種卟啉熒光檢測選擇性比較 分別稱取0.034 55 g K2CO3、0.034 02 g CH3COONa·3H2O、0.027 75 g CaCl2、0.023 81 g MgCl2、0.059 43 g NiCl2·6H2O、0.032 46 g CoCl2、0.043 26 g Mn(CH3COO)2、0.045 87 g Zn(CH3COO)2、0.067 88 g HgCl2、0.069 51 g FeSO4·7H2O、0.042 5 g AgNO3于燒杯中溶解后，配制25 mL 10-2mol/L的金屬離子儲備液。進行選擇性測試時，以醋酸-醋酸鈉緩沖液作為稀釋劑，將金屬離子溶液定容于10 mL容量瓶中。其中，卟啉及重金屬離子濃度分別為 10-5mol/L 和20 μmol/L，在相同熒光測試條件下，檢測體系的熒光光譜變化，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 P2OH檢測不同金屬離子的熒光比率變化Fig.3 The fluorescence ratio changes of P2OH bydetecting different metal ions

圖4 P4OH檢測不同金屬離子的熒光變化Fig.4 The fluorescence ratio changes of P4OH bydetecting different metal ions

由圖可知，只有在Hg2+存在下，檢測體系才會發(fā)生明顯的變色(由紫色變?yōu)辄S綠色)。除了Zn2+，Cu2+和Hg2+，大部分金屬離子的I605 nm/I650 nm和I609 nm/I655 nm熒光發(fā)射峰強度比值很小。Cu2+體系熒光衰減較快，熒光峰強度不穩(wěn)定；Zn2+體系雖然有兩個峰，對金屬離子濃度改變不敏感，且其系統(tǒng)無顏色變化，檢測靈敏性低。只有Hg2+檢測體系，既有有效的熒光峰強度，又保證在兩個波長處發(fā)射峰明顯的區(qū)別，且顯示熒光體系從紫紅變?yōu)辄S綠色。

2.2.2 P2OH和P4OH熒光檢測痕量Hg2+的靈敏度比較 在0.2～50 μmol/L Hg2+溶液中，分別利用P2OH和P4OH檢測Hg2+，結(jié)果見圖5A和圖6A。

由圖可知，隨著Hg2+濃度的增加，P2OH和P4OH在605 nm和609 nm處熒光發(fā)射峰的強度升高，在 650 nm 和655 nm處的熒光發(fā)射峰的強度降低，導(dǎo)致熒光比率值增加。通過熒光比率值取對數(shù)后，對Hg2+濃度的對數(shù)值進行擬合，結(jié)果見圖5B和圖6B。

圖5 P2OH檢測不同濃度的汞離子Fig.5 The fluorescence detection of Hg2+ by P2OHA.熒光變化圖；B.熒光比率變化擬合結(jié)果

圖6 P4OH檢測不同濃度的汞離子Fig.6 The fluorescence detection of Hg2+ by P4OHA.熒光變化圖；B.擬合直線

由圖可知，擬合直線相關(guān)系數(shù)都在0.99以上，P2OH和P4OH對汞離子的檢測均具有較高的準(zhǔn)確性，P4OH的準(zhǔn)確性更高，擬合系數(shù)達0.998 3。

參考文獻[10]，通過多次檢測空白溶液，計算熒光標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到P2OH和P4OH對Hg2+的檢出限見表2。

表2 兩種對稱中位取代羥基卟啉的熒光檢測下限Table 2 Detection limits of two symmetricallysubstituted hydroxyporphyrins

由表2可知，檢出下限總體處于同一數(shù)量級，且P2OH的檢出限更低。這主要是P4OH分子中卟啉環(huán)外圍中位含有更多的羥基，導(dǎo)致探針分子之間氫鍵作用較強，使其自身更容易聚集導(dǎo)致。

2.2.3 不同pH條件下P2OH和P4OH檢測體系穩(wěn)定性 選取Hg2+濃度為0.05 mmol/L體系，以pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為基礎(chǔ)，分別使用1 mol/L鹽酸和1 mol/L 氫氧化鈉在酸度計監(jiān)測下，配制pH在2～10，不同的緩沖體系，作為不同的稀釋劑，測試體系在不同pH值下的熒光光譜變化。記錄P2OH和P4OH檢測體系在 605 nm 和 609 nm、650 nm 和 655 nm 處的熒光強度，得到兩種卟啉的熒光比率值隨pH變化的關(guān)系曲線，見圖7和圖8。

圖7 不同pH 條件下P2OH-Hg2+體系熒光變化Fig.7 The fluorescence ratios of P2OH-Hg2+under different pH

圖8 不同pH 條件下P4OH-Hg2+體系熒光變化Fig.8 The fluorescence ratios of P4OH-Hg2+under different pH

由圖可知，P2OH體系在pH值為3～9的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在pH為6時熒光比率值出現(xiàn)拐點；P4OH熒光體系在pH值為2～10的范圍內(nèi)，熒光比率值穩(wěn)定。比較兩個曲線發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對稱性卟啉環(huán)外圍取代羥基數(shù)目增加時，檢測體系熒光比率值在上述pH范圍內(nèi)數(shù)值更穩(wěn)定。尤其當(dāng)溶液pH值在2～10內(nèi)范圍內(nèi)變化，P4OH檢測體系的熒光比率值幾乎保持不變。這是因為P4OH外圍取代羥基存在解離平衡，羥基上氫離子的數(shù)目較多，更易平衡體系的酸堿變化，從而增加檢測溶液的pH穩(wěn)定性。

2.2.4 P2OH和P4OH的時間穩(wěn)定性比較 選取Hg2+濃度為0.05 mmol/L的檢測體系，連續(xù)測定10 min內(nèi)其溶液的熒光光譜，同時記錄P2OH和P4OH在 605 nm 和 609 nm、650 nm和655 nm處的熒光強度，結(jié)果見圖9、圖10。

圖9 P2OH-Hg2+體系時間穩(wěn)定性Fig.9 The fluorescence ratios ofP2OH-Hg2+ in 10 mins

圖10 P4OH-Hg2+體系時間穩(wěn)定性Fig.10 The fluorescence ratios of P4OH-Hg2+ in 10 mins

由圖可知，10 min內(nèi)，P2OH和P4OH的熒光強度基本保持穩(wěn)定，熒光比率值略有上升。因此，P2OH和P4OH熒光探針在10 min內(nèi)檢測體系熒光比率值穩(wěn)定，滿足實際觀測的時間要求。

2.3 P2OH和P4OH與Hg2+的結(jié)合性分析

為探明P2OH和P4OH與Hg2+的結(jié)合性強弱，利用Gaussian09軟件的B3LYP模式6-31G (d) basis set，對其軌道能量進行計算，并分析meso-羥基及中心N在卟啉軌道中的含量百分比，結(jié)果見圖11和表3。

圖11 兩種羥基卟啉的軌道能量圖Fig.11 Orbital energy of two hydroxyporphyrins

卟啉類型—OH在HOMO中的羥基占比/%—OH在LUMO中的占比/%中心N在HOMO中的占比/%中心N在LUMO中的占比/%P2OH0.7030.032 015.06.04P4OH1.230.18814.56.28

當(dāng)meso-羥基數(shù)目增加時，探針分子最高占據(jù)分子軌道(HOMO)和最低未占分子軌道(LUMO)的軌道能量均上升，但其禁帶寬度呈下降趨勢。這表明，P4OH分子在檢測過程中更容易被激發(fā)。從 —OH及中心N的軌道占比可推測：當(dāng)探針分子中的meso-羥基數(shù)目增加時，其對探針分子的HOMO和LUMO軌道能量的貢獻均有不同程度的上升，meso-羥基取代對HOMO的增加更顯著。這說明隨著meso-羥基數(shù)目的增加，外圍羥基作為金屬離子配位點的結(jié)合幾率增加，而中心N與金屬離子的配位幾率下降。

3 結(jié)論

(1)合成了兩種對稱結(jié)構(gòu)的中位羥基取代卟啉P2OH、P4OH，并利用二者熒光檢測水體Hg2+，檢測體系不但顯示明顯的顏色變化(從紫紅到黃綠色)，而且顯示熒光比率變化。兩種羥基卟啉熒光檢測體系的熒光比率值對數(shù)與水體汞離子濃度的對數(shù)，具有較強的線性相關(guān)性，擬合系數(shù)均高于0.99，檢測下限分別達0.039 54 μmol/L和0.052 01 μmol/L。

(2)檢測體系熒光穩(wěn)定性較強，P2OH和P4OH檢測體系在10 min熒光強度均穩(wěn)定，且在pH值為3～9范圍內(nèi)均維持穩(wěn)定。

(3)軌道計算結(jié)果顯示，隨著meso-羥基數(shù)目增加，羥基卟啉傾向于通過中位N及卟啉環(huán)外圍 —OH 共同結(jié)合更多Hg2+，卟啉環(huán)外圍中位羥基作為金屬離子配位點的結(jié)合幾率增加，而中心N與金屬離子的配位幾率下降。

(4)對水體Hg2+的檢測過程中，P4OH比P2OH顯示了更優(yōu)異的熒光檢測特性。