RNA酶Rrp44的結(jié)構(gòu)和功能

劉洪巖，薛暉，張世勇，趙彥華，王明華，邊文冀，陳校輝

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

細(xì)胞內(nèi)核糖核酸（RNA）的合成和降解必須達(dá)到一個微妙的平衡，破壞這種平衡會對細(xì)胞功能產(chǎn)生重大影響[1]，在這一平衡中，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后降解起到同樣重要的作用。RNA降解涉及許多復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的途徑，其中RNA酶起到了重要作用。除了作為一種基因調(diào)控手段，RNA酶還可以清除異常信使核糖核酸（mRNA），以防止有毒蛋白質(zhì)產(chǎn)品的積累。此外，大多數(shù)初級轉(zhuǎn)錄本都經(jīng)過RNA酶的剪切，才能產(chǎn)生具有多種功能的成熟RNA。

Rrp44是一種高度保守的3’到5’外切RNA酶，是RNA外切酶復(fù)合體的催化亞基[2]。Rrp44在RNA代謝中具有多種功能，包括mRNA質(zhì)量控制[3]、基因表達(dá)調(diào)控[4]和小RNA加工[5]，同時，Rrp44在生物體水平上與染色體分離[6]，B細(xì)胞中抗體的多樣化相關(guān)。現(xiàn)簡述Rrp44的結(jié)構(gòu)及分子和生物學(xué)功能。

1 Rrp44的結(jié)構(gòu)、功能以及亞細(xì)胞定位

Rrp44同源物屬于核糖核酸酶Ⅱ（RNase II）超家族，該家族成員具有很高的序列保守性和功能保守性[5]。Rrp44由一個具有外切酶活性RNB結(jié)構(gòu)域、兩個CSDS結(jié)構(gòu)域、一個S1結(jié)構(gòu)域、一個具有內(nèi)切酶活性PIN結(jié)構(gòu)域以及N端含有三個半胱氨酸殘基的CR3結(jié)構(gòu)域[6]組成。

Rrp44是一種高效的RNA酶，從3’到5’端水解單鏈RNA，一次釋放一個核苷酸。Rrp44外切酶的活性主要依賴RNB催化中心的4個保守的天冬氨酸殘基以及與其相互作用的兩個鎂離子[7]，該位點(diǎn)埋在狹窄通道的底部，只有含有7個以上核苷酸的單鏈RNA才能通過該結(jié)構(gòu)域；同時，RNB活性位點(diǎn)可以識別具有分子內(nèi)或分子間二級結(jié)構(gòu)的底物，只要在RNA的5’端有4～5 nt的未配對核苷酸，Rrp44就可以進(jìn)行降解。催化結(jié)構(gòu)PIN的活性位點(diǎn)由四種酸性氨基酸組成，它們與兩種二價金屬陽離子結(jié)合。PIN結(jié)構(gòu)域不能降解雙鏈RNA，但是環(huán)狀和線性單鏈RNA都是它的底物[8]。

核酸酶的亞細(xì)胞定位是RNA表達(dá)后調(diào)控的重要機(jī)制。一般認(rèn)為Rrp44位于核內(nèi)，但是在細(xì)胞質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)少量的Rrp44。然而不同種類的細(xì)胞，Rrp44的亞細(xì)胞定位不同，在一些果蠅S2細(xì)胞中，Rrp44存在于細(xì)胞質(zhì)中，在HEK-293細(xì)胞系Rrp44僅在細(xì)胞核中表達(dá)。同時，Rrp44還可以根據(jù)細(xì)胞周期進(jìn)程或生長條件的變化改變其亞細(xì)胞定位。Rrp44的細(xì)胞核定位是由C端兩個核定位信號控制的。N端結(jié)構(gòu)域似乎也有助于Rrp44亞細(xì)胞定位，但是N端不存在核定位序列[9]。目前認(rèn)為，N端結(jié)構(gòu)域可能包含一個額外的調(diào)控序列，可能通過穩(wěn)定蛋白的三級結(jié)構(gòu)，從而使C端核定位信號發(fā)揮作用。

2 Rrp44的分子功能

RNA的不斷合成和降解是細(xì)胞功能正常的代謝變化，該過程與外切酶復(fù)合體相關(guān)。Rrp44在mRNA質(zhì)量控制、基因表達(dá)調(diào)控和小RNA加工中發(fā)揮作用。

2.1 Rrp44在mRNA降解中的作用

真核生物的mRNA降解涉及許多復(fù)雜而相互關(guān)聯(lián)的途徑，它們都匯聚在三種共同的機(jī)制上。mRNA降解首先必須消除二級結(jié)構(gòu)，變成單鏈的RNA，再通過脫腺苷化作用刪除polyA尾巴，從而被Rrp44從3’端開始降解；脫去5’端的帽子結(jié)構(gòu)，被核糖核酸外切酶從5’端開始降解。最后，轉(zhuǎn)錄本可以通過核內(nèi)裂解產(chǎn)生兩個片段，這兩個片段容易被Rrp44或RNA酶XRN1降解。在mRNA降解途徑的上游，還存在著許多其他途徑，以便靶向底物至特定的途徑，從而進(jìn)行降解[3]。這些上游途徑可分為質(zhì)量控制和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控兩條路徑。

（1）Rrp44在RNA質(zhì)量控制通路中的作用。細(xì)胞必須檢測異常和錯誤的轉(zhuǎn)錄本，以防止產(chǎn)生潛在的有毒蛋白質(zhì)。監(jiān)視機(jī)制存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，以檢測mRNA產(chǎn)生和成熟的所有階段的錯誤。在細(xì)胞核中，由于轉(zhuǎn)錄、加工或輸出錯誤會導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的mRNA，這些錯誤的mRNA都會被降解。3’—5’和5’—3’途徑都參與核mRNA降解，但具體使用哪一種途徑取決于底物特異性。目前研究結(jié)果表明，外切酶復(fù)合體可特異性降解未剪接的mRNA前體[3]和轉(zhuǎn)錄錯誤的mRNA。

細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生的mRNA監(jiān)視途徑則依賴于翻譯，包括無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）、無終止降解（non-stop decay,NSD）和停滯降解（no-go decay,NGD）。NMD降解是由包含一個提前終止密碼子（PTC）的轉(zhuǎn)錄本觸發(fā)的，隨后，相關(guān)蛋白結(jié)合到被降解的轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致mRNA通過5’—3’或3’—5’途徑降解[10]。NSD降解以缺乏終止密碼子的mRNA為目標(biāo)，這類mRNA翻譯時，核糖體會沿著polyA尾巴繼續(xù)翻譯。在酵母和哺乳動物細(xì)胞中，mRNA3’端的核糖體被GDP結(jié)合蛋白Ski7檢測到，接下來Ski7會招募Ski復(fù)合體和外切酶復(fù)合體并降解轉(zhuǎn)錄本[11]。NGD降解則阻止了具有強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本的翻譯。當(dāng)核糖體被mRNA的強(qiáng)二級結(jié)構(gòu)中止后，mRNA在核內(nèi)被裂解。這一過程中相關(guān)的內(nèi)切酶尚未確定，目前認(rèn)為真核翻譯釋放因子eRF1和eRF3相關(guān)蛋白Dom34和HSB1[4]參與其中。一旦轉(zhuǎn)錄本被分裂成兩個片段，它會被外切酶復(fù)合體或RNA酶XRN1降解。

（2）Rrp44在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的作用。mRNA降解是一種基因表達(dá)調(diào)控的方式。這種調(diào)控方式可以通過3’非翻譯區(qū)中不穩(wěn)定的順式元件RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）誘導(dǎo)發(fā)生。目前發(fā)現(xiàn)兩種不穩(wěn)定的順式元件：富含AU的順式作用元件（AU-rich elements,ARE）和富含GU的順式作用元件（GUrich elements,GRE），它們大多存在于mRNA的3’非編碼區(qū)中。ARE存在于介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)節(jié)反應(yīng)的短壽命mRNA中，如編碼炎癥因子的mRNA。ARE通過招募轉(zhuǎn)錄因子來影響轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。這些ARE結(jié)合蛋白與CCR4-NOT復(fù)合物結(jié)合，隨后被Rrp44和外切酶體復(fù)合物降解[4]。GRE與ARE調(diào)節(jié)不同的基因庫，并對mRNA的穩(wěn)定性有更溫和的影響[12]。

2.2 Rrp44在小RNA成熟和降解中的作用

隨著對RNA降解的深入了解，已經(jīng)有研究證實(shí)，并非所有RNA降解的目的都是將RNA底物完全降解。Rrp44和外切酶體復(fù)合物能夠參與小RNA的加工。核糖體RNA（ribosomal RNA,rRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA,snoRNA）、小核RNA（small nuclear RNA,snRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA,tRNA）均被轉(zhuǎn)錄為前體RNA，這些前體RNA必須經(jīng)過剪切、修飾才能產(chǎn)生有功能的小RNA[13]。在這一過程中，外切酶復(fù)合體通過將前體RNA3’端降解，使其成為成熟的、穩(wěn)定的RNA。

例如，酵母中的rRNA合成始于核仁中35S前體rRNA的合成。前體rRNA在細(xì)胞核內(nèi)部經(jīng)過一系列步驟被降解，產(chǎn)生一些更小的片段，包括7S中間體。外切酶體復(fù)合物對7S中間體進(jìn)行加工，使其成為成熟的5.8SrRNA[14]。此外，Rrp44在酵母中特異性降解轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）。在酵母中，甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNAiMet）58位的丙氨酸甲基化，對于其正確二級結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要，Rrp44能夠特異性識別該位點(diǎn)，并在TRAMP（ir2/Mtr4 polyadenylation,TRAMP）復(fù)合物的幫助下對A58沒有甲基化的tRNAiMet進(jìn)行降解[15]。

miRNA介導(dǎo)的mRNA降解是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要手段。miRNA能夠結(jié)合到目的RNA片段上面，最終導(dǎo)致目的RNA被降解。因此，miRNA的產(chǎn)生受到多個水平的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體和Rrp44特異性地參與了某些miRNA的成熟過程，包括果蠅羽翼成熟需要的miR-252-5p，miR-982-5p。同樣在果蠅中，一個miRNA家族被發(fā)現(xiàn)編碼在內(nèi)含子中，它們在外切酶復(fù)合體中被加工而不是通過正常的RNA酶Drosha裂解。此外，Rrp44還參與了哺乳動物細(xì)胞中前體miRNA的降解和前體miRNAs的質(zhì)量控制[16]。

3 Rrp44的生物學(xué)功能

在Rrp44突變體中可以觀察到其生物學(xué)功能，此類研究大多在酵母和果蠅中進(jìn)行的。由于Rrp44在真核生物中明顯保守，這意味著對低等生物的研究可能會對了解其在高等生物中的功能有所幫助。

3.1 Rrp44在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用

Rrp44在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起作用。Rrp44最初是在一個突變的裂殖酵母株中被發(fā)現(xiàn)，Rrp44突變后導(dǎo)致姐妹染色單體不分離[1]。隨后發(fā)現(xiàn)，在單個Rrp44突變體中，有絲分裂節(jié)點(diǎn)控制蛋白Mad2抑制有絲分裂進(jìn)程，但在Rrp44和Mad2雙突變體中，由于染色體分離錯誤，導(dǎo)致產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞[17]。進(jìn)一步證明Rrp44的突變影響了微管定位和結(jié)構(gòu)，從而影響了有絲分裂的進(jìn)程。同時，在果蠅S2細(xì)胞中，敲除Rrp44也會影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)[18]。目前認(rèn)為，Rrp44主要參與著絲粒異染色質(zhì)沉默，也因此影響細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程。

3.2 Rrp44在產(chǎn)生抗體多樣性中的作用

在抗體重組的過程中，外切酶復(fù)合體能夠招募脫氨酶。脫氨酶的功能是將甲基化的胞苷殘基和5-羥甲基化的胞苷殘基分別轉(zhuǎn)化為尿嘧啶和胸腺嘧啶，然后被DNA修復(fù)機(jī)制識別并轉(zhuǎn)化為定點(diǎn)斷裂（DSBs），這是免疫球蛋白多樣化過程的一部分[19]。由于脫氨酶只能作用于單鏈DNA（ssD NA），因此這些過程只發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄過程中。在這種修復(fù)過程中產(chǎn)生的RNA會被外切酶復(fù)合體降解。