神秘果干預腫瘤免疫的潛在機制研究

陳 琪，陳珂玉，王一凡，劉炳驛，馬飛祥，張秀艷

（1.內蒙古醫科大學藥學院, 內蒙古呼和浩特 010000；2.呼和浩特市蒙醫中醫醫院(內蒙古醫科大學第一附屬蒙醫中醫醫院), 內蒙古呼和浩特 010020）

癌癥是全球第二大死亡原因[1]。研究認為癌癥的起始與發展不僅與遺傳改變相關。不合理飲食、久坐的生活方式和異常肥胖也被認為是腫瘤發生危險因素[2]。目前，尚未發現癌癥的明確成因以及顯著有效治療手段，一線治療方法仍為手術及放射性療法，但對人體有嚴重副作用，比如身體衰弱、免疫功能下降及神經毒性等副作用。機體免疫功能與腫瘤發生發展密切相關，人體可以通過不同的免疫途徑啟動抗腫瘤免疫應答，從而達到抗腫瘤功能。腫瘤免疫治療相比其他治療方式具有治療范圍廣，臨床預后好，可適用于各種癌癥類型等優點。某些天然活性物質有提高免疫功能，具有預防腫瘤的發生，減少轉移和復發等特點[3]。因此探究具有抗腫瘤活性且低毒副作用的天然活性物質迫在眉睫。

神秘果（Synsepalum dulcificum）是熱帶西非的土產水果，因果肉可以將酸味轉變為甜味的特點被稱神秘果。神秘果因其成分豐富具有巨大潛在保健價值，目前研究發現其果實、種子及葉等部位的提取物均有不同藥理活性，比如降血脂、抗尿酸、抑菌、抗驚厥、抗疲勞等活性[4]。具有諸多生物活性的原因是其果肉中富含酚類化合物（15.8%）和類黃酮（11.9%），果皮含有更高含量的酚類化合物（36.7%）和類黃酮（51.9%）[5]。一般認為酚類和類黃酮含量與抗氧化活性及抗腫瘤之間存在密切關系，高含量的酚類及類黃酮使得神秘果具有干預腫瘤的重要潛在能力[6]。已經報道神秘果提取物可以在體外減少某些惡性腫瘤的增殖，如減少人黑色素瘤、結直腸癌細胞系的增殖和抗人慢性髓系白血病細胞（K562）活性[7?8]。即使神秘果可以干預腫瘤發生發展，但是對于這種果實的抗腫瘤的機制研究仍鮮有報道。

本研究通過液相-質譜聯用技術及網絡藥理學研究手段探究神秘果在腫瘤免疫方面可能發揮的作用，為神秘果的開發利用鋪墊基礎，同樣為抗腫瘤食藥開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

神秘果 購自廣東江門，經內蒙古醫科大學研究員鑒定為山攬科神秘果屬植物，?80 ℃保存；甲醇、乙腈、甲酸 色譜純；其他試劑 均為分析純，天津大茂化學試劑廠。

Triple TOF 5600/6600質譜儀 美國AB SCIEX；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀 美國Agilent；Eppendorf5430R低溫高速離心機 德國Eppendorf；色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide(1.7 μm，2.1 mm×100 mm column)、ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8 μm，2.1 mm×100 mm column) 美國Waters。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜-質譜方法獲得成分

1.2.1.1 樣品預處理 取神秘果樣品適量，去核，凍干后成粉供精密稱取，?80 ℃保存。

上機樣本制備：?80 ℃取出樣本，稱量80 mg，加入 200 μL 水勻漿，渦旋 60 s，加入 800 μL 甲醇乙腈溶液（1:1, v/v），渦旋 60 s，低溫超聲 30 min，2 次，?20 ℃ 放置 1 h 沉淀蛋白，14000 ×g，4 ℃ 離心 20 min，取上清冷凍干燥，?80 ℃保存，上機樣品平行兩次實驗。

1.2.1.2 液相色譜-質譜分析 液相色譜條件：樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(UHPLC)HILIC色譜柱進行分離；柱溫25 ℃；流速0.3 mL/min；流動相組成A：水+25 mol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0~0.5 min，95% B；0.5~7 min，B 從 95%線性變化至65%；7~8 min，B從 65%線性變化至40%；8~9 min，B維持在 40%；9~9.1 min，B從 40%線性變化至95%；9.1~12 min，B維持在95%；整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。為避免儀器檢測信號波動而造成的影響,采用隨機順序進行樣本的連續分析。

質譜條件：分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負離子模式進行檢測。樣品經UHPLC分離后用Agilent 6550質譜儀進行質譜分析。ESI源條件如下：氣體溫度：250 ℃，干燥氣體：16 L/min，霧化氣壓力：20 Psig，殼氣溫度：400 ℃，殼氣流量：12 L/min，Vcap：3000 V，噴嘴電壓：0 V，Fragment：175 V，質量范圍：50~1200，采集速率：4 Hz，循環時間：250 ms。樣本檢測完畢后，采用AB Triple TOF 6600質譜儀對代謝物進行鑒定，采集樣品的一級、二級譜圖。ESI源條件如下：輔助氣壓 1(Gas1)：40，輔助氣壓2(Gas2)：80，氣簾氣體：30，離子源溫度：650 ℃，噴霧電壓±5000 V(正負兩種模式);二級質譜采用信息關聯掃描獲得，并且采用高靈敏度模式，定性離子對去簇電壓：±60 V(正負兩種模式)，碰撞能量：（35±15）eV，IDA設置：不包括同位素4 Da，周期監測的候選離子：10。數據采集是按質量范圍進行分段：50~300、290~600、590~900、890~1200，從而擴大二級譜圖的采集率，每個方法每段采集四個重復。所采集獲得的數據，分別使用MetDDA和LipDDA方法，進行代謝物的結構鑒定。

1.3 神秘果干預腫瘤免疫相關成分

為明確神秘果影響腫瘤免疫的物質基礎，首先將液相-質譜技術獲得的化合物在PubChem Compound (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)中搜索轉化對應唯一標識符Smiles，借助中藥腫瘤免疫數據庫TCMIO[9](http://tcmio.xielab.net/)尋找神秘果成分中含有干預腫瘤免疫相關化合物，明確具體免疫相關化學成分及收錄對應靶點。

1.4 靶點生物學功能信息

為更好地了解神秘果中相關免疫化合物靶點的生物學功能，將整理得到的化合物靶點信息利用R語言包clusterProfiler[10]富集分析，經過合理統計學閾值明確對應的生物學功能，包括生物過程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cellular component，CC）。

1.5 化合物-靶點關系分析

根據成分與相關靶點的關系可構建神秘果作用腫瘤免疫的生物關系網絡拓撲圖，通常在生物關系網絡中，居于關鍵位置的基因起到的調控的作用更加重要，借助Cytoscape軟件構建化合物-靶點互作網絡，并從網絡中選取核心靶點進一步分析。

1.6 核心靶點在不同腫瘤的表達差異

挑選出調控網絡的關鍵基因后，為明確目標靶點在不同腫瘤中的表達差異，借助GEPIA數據庫[11](http://gepia.cancer-pku.cn/)記錄的33種腫瘤中與正常樣本數據進行對比，統計條件為表達值經過對數處理，差異統計方法采用方差分析，|Log2FC|>1，P<0.01，對比數據包括TCGA及GTEx數據。

1.7 化合物影響通路

進一步了解神秘果影響腫瘤免疫的信號通路，通過CTD數據庫[12]（http://ctdbase.org/）富集相關化合物的信號通路，以P<0.01進行篩選。

1.8 神秘果中成分與靶點的相互作用

前面工作得到在腫瘤中有明顯表達差異的基因，為明確神秘果相關成分對得到的靶點具體相互作用，通過文獻及分子對接技術進行驗證。神秘果含有化合物可能直接參與靶點基因的表達過程以及產物的翻譯修飾途徑，還可能與蛋白質直接相互作用進而影響蛋白質功能，借助TCMSP數據庫收錄的化學物質結構信息，下載神秘果相關化學成分結構并保存為 MOL2 格式，使用 Discovery Studio（DS）軟件進行化學成分配體的處理。使用RCSB數據庫（http://www1.rcsb.org/）下載蛋白質結構文件。用DS軟件進行蛋白預處理，包括清除原配體，去水加氫，施加力場等，LibDock執行分子對接計算并分析所得結果。

2 結果與分析

2.1 神秘果肉成分的鑒定

平行兩組樣品經UHPLC-Q-TOF MS分析后得到的典型TIC圖譜,如圖1所示。通過保留時間（tR），裂解規律以及數據庫的搜索得到樣品共有成分為181種，數據未給出。

圖1 神秘果離子模式TIC圖譜Fig.1 TIC spectrum of Synsepalum dulcificum ion mode

2.2 神秘果果肉干預腫瘤免疫相關成分信息

經過搜索對比，在TCMIO數據庫中得到神秘果可干預腫瘤免疫相關成分42個，同時整理其干預相關靶點55個。化合物詳細信息表1。

表1 神秘果干預腫瘤免疫相關成分信息Table 1 Information on relevant components of Synsepalum dulcificum 's intervention in tumor immunity

2.3 神秘果影響腫瘤免疫靶點生物過程、分子功能、細胞成分結果

整理分析得到神秘果影響腫瘤免疫相關靶點55個，經過GO注釋分析及KEGG通路分析，篩選得到P值及FDR值均小于0.01，如圖2所示，各項P值前三信息,主要結果生物過程為肽酰酪氨酸磷酸化、肽酰酪氨酸修飾、磷脂酰肌醇3-激酶信號，分子功能為蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性，細胞定位為基底外側質膜、膜筏、膜微區，KEGG為PI3K-AKT信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、腫瘤中蛋白聚糖相關途徑。

圖2 神秘果干預腫瘤免疫相關靶點的 GO 功能富集及KEGG 通路分析Fig.2 GO function enrichment and KEGG pathway analysis of Synsepalum dulcificum intervention on tumor immune-related targets

續表1

續表1

2.4 篩選核心化合物及靶點

將得到的化合物及對應靶點相互關系導入Ctyoscape中，接借助Networkanalyzer計算網絡拓撲參數，Degree值前五的基因為核心靶點分別為：TSHR(Degree=42)、TP53(Degree=39)、MAPK1(Degree=39)、HIF1A(Degree=30)、CA9(Degree=28)繼續研究，見圖3。

圖3 神秘果干預腫瘤免疫的“成分-靶點”網絡Fig.3 "Component-target" network of Synsepalum dulcificum intervening tumor immunity

2.5 核心靶點的臨床意義

篩選得到核心靶點，也被認為神秘果影響腫瘤免疫的主要作用靶點，利用Gepia內置數據得到核心基因在不同腫瘤中差異情況不一，見圖4~圖8。CA9在 ACC、 BLCA、 CESC、 COAD、 ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、READ、UCEC、UCS中高 表達，而在 LAML、SKCM、STAD、TGCT中低表達，HIF1A在ESCA、GBM、HNSC、LGG、PAAD、STAD高 表 達 ，MAPK1在 LGG、PAAD、STAD中高表達，在ACC、DLBC、LAML低 表 達 ，TP53在 COAD、DLBC、GBM、LAML、LGG、LUSC、OV、PAAD、READ、STAD、TGCT、THYM、UCEC均高表達，TSHR在LAML、LGG、THYM 高表達。發現即使同一靶點在不同腫瘤的表達趨勢也不一致，證明腫瘤免疫的復雜性和多面性。

圖4 CA9在不同腫瘤中表達差異Fig.4 Differential expression of CA9 gene in different tumors

圖8 TSHR在不同腫瘤中表達差異Fig.8 Differential expression of TP53 gene in different tumors

圖5 HIF1A在不同腫瘤中表達差異Fig.5 Differential expression of HIF1A gene in different tumors

圖6 MAPK1在不同腫瘤中表達差異Fig.6 Differential expression of MAPK1 gene in different tumors

圖7 TP53在不同腫瘤中表達差異Fig.7 Differential expression of TP53 gene in different tumors

2.6 相關化合物影響的信號通路

明確神秘果相關化合物影響體內的信號通路，篩選后結果得到1479條信號通路，著重分析P值排名前十信號通路，可見神秘果相關成分影響的信號通路為免疫系統、先天免疫系統等途徑（表2）。

表2 神秘果影響腫瘤免疫相關化合物影響信號通路Table 2 Synsepalum dulcificum affects tumor immunity-related compounds affect signal pathways

2.7 化合物對核心基因的影響

通過文獻檢索，對于上文篩選的神秘果影響腫瘤免疫的42種化合物以及篩選的關鍵化合物進行搜索,得到化合物與核心基因的相互關系。可見神秘果眾多化合物可影響多個靶點，佐證文獻見表3。

表3 神秘果化合物對核心基因的影響Table 3 Effects of Synsepalum dulcificum compounds on hub genes

2.8 分子對接結果

篩選得到核心蛋白 TSHR（PDB：2xwt）、TP53（PDB：3q01）、MAPK1（PDB：4fv6）、HIF1A（PDB：1l8c）、CA9（PDB：6tl5）立體結構與 42 種化合物進行分子對接，僅展示對接分數第一的化合物與對應靶點對接模式圖，結果發現 Procyanidin b2、Daturic acid及Guanosine與核心蛋白對接良好，表明篩選化合物可能直接結合蛋白質進而改變其功能，見圖9。進一步分析化合物與關鍵靶點的互作位置及相互作用方式，進而明確結合蛋白的關鍵位置，將得分最高化合物以多種構象化合物與蛋白對接，結果以熱圖呈現，見圖10。發現 TP53的 GLU271、GLU285、ARG273、ARG249、SER249的氨基酸位點，HIF1A的 ALA34、HIS18、VAL148位點以及CA9的A200位置可以與Procyanidin b2形成氫鍵，MAPK1的 ARG351、ARG75與 Daturic acid形成氫鍵及靜電相互作用，TSHR的PHE141、ASP143、ILE117、TYR116與 Guanosine形成氫鍵及碳氫鍵。結果表明上述蛋白氨基酸殘基可能在與神秘果化合物結合過程中發揮重要作用。

圖9 蛋白質與化合物對接圖Fig.9 Protein and compound docking diagram

圖10 化合物與蛋白質相互作用圖Fig.10 Diagram of the interaction between compound and protein

3 討論與結論

本實驗探究神秘果干預腫瘤免疫進而輔助治療腫瘤的可能性，通過液相-質譜聯用技術及生物信息數據挖掘神秘果治療腫瘤的潛在機制。發現神秘果干預腫瘤免疫過程中可能影響的主要靶點如下：TSHR為促甲狀腺激素受體，正常表達于甲狀腺濾泡上皮細胞的細胞膜上，屬于G蛋白偶聯受體，其與TSH結合后被激活，進而激活cAMP-PKA信號通路，TSHR的缺失可能會促進甲狀腺乳頭狀癌的增殖、侵襲能力[42]。HIF1為缺氧誘導因子-1，是細胞在缺氧狀態下的關鍵調控蛋白，調節一系列細胞因子和生長介質的表達及蛋白質合成，對腫瘤血管的形成和對腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲、凋亡、能量代謝等作用有著重要的影響[43]，HIF-1的表達程度與腫瘤的惡性程度、新生血管的表達程度及預后不良呈正相關。抑制HIF-1的表達，阻斷缺氧信號的傳遞，已經成為腫瘤治療的新思路，而神秘果中有諸多成分，如楊梅素、槲皮素等均可影響靶點的表達。TP53是腫瘤研究中熱點靶點，有超過 50%的腫瘤中存在TP53的基因突變，其中大多數都錯義突變。突變型p53蛋白，不僅失去了野生型蛋白的腫瘤抑制功能，反而能促進腫瘤的發生和進展[44]。研究同時也發現神秘果含有抗腫瘤免疫成分42種，通過文獻發現，部分的化合物對腫瘤免疫已有積極意義的報道。如槲皮素可以抑制淋巴細胞活化和增殖來發揮免疫調節作用。在對白血病細胞系的研究中，槲皮素對白血病細胞系的凋亡潛能高于外周血單核細胞，同時能夠抑制T細胞增殖和活化等正常免疫功能[45]，同時槲皮素可誘導多種腫瘤細胞凋亡，如肝癌細胞[46]、肺癌[47]，槲皮素通過滅活 caspase/Cyto-c途徑、抑制AP-23/h TERT、抑制 NF-κB/COX-2和阻斷 Akt/ERKl/2信號通路而發揮抗腫瘤作用[48]。苦杏仁苷作為一種天然產生的氰化物，具有不影響正常細胞的情況下發揮抗腫瘤的作用，可通過直接抑制腎移植大鼠的免疫細胞的增殖進而干預免疫功能[49]，同樣對影響膀胱癌細胞(UMUC-3、RT112、TCCSUP) 的附著和遷徙[50]，通過cDNA 微列分析發現苦杏仁甙能明顯下調細胞周期相發揮抗腫瘤作用[51]。原花青素作為中藥中廣泛存在的多酚類化合物具有良好的抗腫瘤作用，可能通過增加線粒體膜通透性和細胞色素C從線粒體中釋放及激活腫瘤細胞內的細胞凋亡蛋白酶和半胱天冬酶誘導腫瘤細胞凋亡，可抑制多種腫瘤細胞的生長[52]，例如抗黑素瘤[53]及前列腺癌[54]。

綜上，神秘果作為干預腫瘤的一種輔助治療選擇，是非常有潛力的，神秘果含有較多活性成分可以改善腫瘤患者的免疫水平進而影響腫瘤的發生發展。但以上部分實驗仍為預測，需要繼續實驗驗證以進一步確認結果，希望神秘果在腫瘤及免疫方面得到出色發揮，為抗腫瘤提供更多的選擇。