紫外分光光度法與熒光光譜法探究呈味核苷酸與EGCG及其蛋白絡合物的相互作用

張 月，喻雪蓮，田月月，張麗霞,

（1.山東農業大學園藝科學與工程學院, 山東泰安 271000；2.濱州學院, 山東濱州 256600）

呈味核苷酸在食品鮮味方面有著重要貢獻，其中以肌苷-5'-磷酸二鈉（Inosine 5'-monophosphate，IMP）和鳥苷-5'-磷酸二鈉（Guanosine 5'-monophosphate, GMP）為代表。IMP在肉類和水產品的鮮味呈現中有重要作用[1]，GMP廣泛存在于植物中，對菌類鮮味有明顯提升效果[2]。Fuke等[3]發現IMP、GMP鮮味閾值分別為0.025%、0.0125%，兩者1:1混合后閾值降低至0.0063%且與谷氨酸存在協同增鮮效應。(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯( (-)-Epigallocatechin gallate, EGCG)是茶葉中主要的澀味物質，與口腔中富脯氨酸蛋白（PRPs，salivary prolinerichproteins）通過氫鍵或疏水作用可產生收斂感覺[4?5]。

滋味是茶葉品質的重要影響因素，是茶葉中水溶性物質相互作用的結果，其中澀味和鮮味對整體滋味的影響最大。現普遍認為，茶葉澀味主要來源于(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallcatechin 3-gallate，EGCG），鮮味主要來源于氨基酸類物質，但在實際研究中，生化成分含量與感官審評結果之間存在一定矛盾，較多茶葉中EGCG含量較高卻無明顯澀味，游離氨基酸含量較高強卻無明顯鮮味[6?8]。有研究顯示，白茶萎凋過程中呈味核苷酸含量大幅增加且參與了白茶鮮味呈現，但其在茶葉中呈味機理鮮有報道[9?10]。鮮味會增加人們對食物的攝取，苦澀味則相反[11]。在茶葉產業中，一定程度上降低茶湯澀味、增加鮮味會提高茶葉品質[12]。因此，探究茶葉中EGCG及其蛋白絡合物是否會與呈味核苷酸發生反應，從而降低澀味對全面了解茶湯滋味有重要意義。

本研究通過紫外分光光度法和熒光光譜法對茶葉中呈味核苷酸與EGCG及其蛋白絡合物的相互作用研究，探究其相互作用產生的機理，進一步了解茶湯中鮮味和澀味來源，從而對全面解釋茶葉滋味提供新的角度，為茶葉加工提供理論支持和新的發展思路，在茶風味食物與飲料的研發過程中對EGCG澀味的掩蓋提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EGCG 純品 純度>98%，上海Macklin；肌苷-5’-磷酸二鈉鹽 純度 99%，上海 Aladdin；鳥苷-5’-單磷酸二鈉鹽 純度≥99%，上海Sigma；牛血清蛋白純度97%，北京Solarbio。

FA1004A分析天平 上海精天電子儀器有限公司；Cary Eclipse熒光分光光度儀 美國Varian公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 Tris-HCl緩沖液的配制 稱取6.056 g三羥甲基氨基甲烷置于1 L燒杯中，加入800 mL超純水，充分溶解后，用鹽酸調節溶液pH7.4。將溶液定容至1 L，放置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.1.2 標準品溶液母液配制 BSA（分子量67000）溶液：濃度 6.0×10?5mol/L，用 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH7.4）配制；

EGCG、IMP、GMP 溶液：濃度均為 1.0×10?3mol/L，用超純水配制，用時稀釋至合適濃度。

1.2.2 呈味核苷酸與EGCG的相互作用

1.2.2.1 呈味核苷酸與EGCG單體及相互作用的紫外吸收光譜 紫外-可見吸收光譜法是研究兩個物質相互作用最簡單常用的方法[13]，通過吸收峰位置和吸收強度的改變可判斷兩者是否發生相互作用[14]。

將EGCG、IMP、GMP溶液分為A、B、C三組，母液稀釋10倍，每組在一系列10 mL容量瓶中按梯度依次加入0~4.0 mL的單一稀釋液，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）定容至刻度，在室溫下作用30 min，選取光譜范圍為220~300 nm，在紫外光譜吸收光譜儀上記錄吸收圖譜。

在一系列10 mL容量瓶中，均加入2 mL EGCG溶液，然后依次加入不同濃度的呈味核苷酸溶液，混合均勻，用 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）定容至刻度，在室溫下作用30 min，選取光譜范圍為220~300 nm，在紫外光譜吸收光譜儀上記錄吸收圖譜。

1.2.2.2 呈味核苷酸與EGCG相互作用結合常數的計算 根據Stephanos等[15?16]描述的方法計算結合常數K的值。假設水溶液中呈味核苷酸和EGCG之間只有一種相互作用，方程(1)和(2)可以成立：

假設(EGCG：呈味核苷酸)=CB

C呈味核苷酸和CEGCG是相對應物質在溶液中的濃度

根據 Beer–Lambert定律

其中A0和A分別是呈味核苷酸不存在和存在時278 nm處的EGCG吸光值。ε呈味核苷酸和εEGCG分別是呈味核苷酸和EGCG的摩爾消光系數。ι為吸收厚度。

將式(4)、(5)帶入(3)，可得式(6)

因此，1/(A-A0)與1/C呈味核苷酸呈線性關系，結合常數(K)可由截距與斜率之比估算得出。

1.2.3 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物的相互作用

1.2.3.1 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物相互作用的光譜測定 多酚與蛋白質的相互作用是近年來食品領域的研究重點, 在食品加工、包裝等方面已取得較多成果[17?19]。BSA常作為蛋白質模型來研究小分子與蛋白質的相互作用[20]，BSA有色氨酸和甘氨酸殘基，存在熒光特性，可利用光譜法探究 IMP、GMP與EGCG蛋白絡合物的相互作用。

在一系列10 mL容量瓶中，均加入2 mL EGCG溶液（濃度為 2×10?5mol/L），2 mL BSA 溶液（濃度為2×10?6mol/L），然后依次加入不同濃度的呈味核苷酸溶液，混合均勻，用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）定容至刻度，在室溫下作用30 min，在紫外光譜吸收儀和熒光光譜儀上記錄吸收圖譜和熒光發射光譜。

1.2.3.2 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物相互作用熒光淬滅類型的計算 根據Steam-Volmer方程判斷淬滅類型[21?22]。

式中，F0與F分別為不存在與存在淬滅劑時體系的熒光強度；Ksv為淬滅常數；[Q]為淬滅劑濃度；Kq為雙分子熒光淬滅速率常數；τ0為不存在淬滅劑時物質的熒光平均壽命, 一般生物大分子的熒光平均壽命為1×10?8s。當熒光體為生物大分子時, 其最大擴散常數 Kq為 2 ×1010( mol/L )?1s?1。

根據公式（7）計算所得Kq值與之比較, 若 Kq>2 ×1010( mol/L )?1s?1，則屬于靜態淬滅，若 Kq<2 ×1010( mol/L )?1s?1，則屬于動態淬滅。

1.2.3.3 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物相互作用結合常數和結合位點的計算 對于靜態淬滅，可采用公式（8）計算結合常數KA和結合位點數n。

式中：F0和F分別是不存在和存在淬滅劑時溶液的熒光強度；KA為表觀結合常數；n為結合位點數；[Q]為淬滅劑濃度。通過log[（F0-F）/F]和log[Q]作圖可求出結合常數KA和結合位點數n[23]。

1.3 數據處理

運用Excel進行數據分析與處理；Origin 2021作圖。

2 結果與分析

2.1 各滋味物質單體的紫外吸收光譜

如圖1所示，各滋味物質（EGCG、IMP、GMP）單體的紫外吸收特性良好，且紫外吸收強度隨物質濃度的增加而增大。EGCG、IMP、GMP的最大吸收峰分別在278、249、253 nm附近，GMP在 280 nm處顯示有一個副峰。此結果與丁奇[24]、王婧[25]的結果一致。

圖1 三種滋味物質的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of three flavor substances

2.2 呈味核苷酸與EGCG的相互作用

2.2.1 呈味核苷酸與EGCG相互作用的紫外吸收光譜圖 以固定 EGCG 的濃度（2.0×10?5mol/L）為背景，添加不同濃度的呈味核苷酸下紫外吸收圖譜如圖2所示，由圖1（A）可知，此濃度下EGCG的紫外吸收值為1.77，三個混合體系的吸收值均遠遠低于EGCG的吸收值。EGEG-IMP混合體系的紫外吸收值集中在0.3附近且只在278 nm處存在一個吸收峰；EGCG-GMP混合體系中，隨著GMP明度的增加，250 nm處的峰谷處吸收值逐漸升高，當GMP濃度為1.2×10?5mol/L時，峰谷變得平直，GMP濃度再增大時開始產生副峰，峰的位置在255 nm處，GMP濃度為3.2×10?5mol/L時，副峰高度超過主峰；EGCG-IMP-GMP混合體系中，主、副峰位置不變，但副峰吸收值均低于主峰，也均低于EGCG-GMP體系。以最大混合濃度為例，擬合EGCG與IMP、GMP、IMP-GMP相互作用的紫外吸收值（圖D虛線）與實際紫外吸收值（圖D實線）發現，EGCG與呈味核苷酸相互作用后吸收值與峰形均發生改變，EGCG特征峰仍然存在但吸收值明顯小于兩者簡單相加，且相互作用后的圖譜在250 nm處的特征峰明顯。

圖2 EGCG與呈味核苷酸相互作用的紫外吸收光譜及理論擬合圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum and theoretical fitting diagram of the interaction between EGCG and taste nucleotide

2.2.2 呈味核苷酸與EGCG相互作用的結合位點根據公式（6）得呈味核苷酸濃度和混合溶液吸收值的雙倒數圖如圖3所示，結合常數K分別為0.01086、0.10835、0.03915，線性關系良好。圖A中忽略三個較高濃度（cIMP=3.2×10?5、3.6×10?5、4.0×10?5mol/L）后線性關系良好，結合紫外吸收圖譜，三種混合方式均與EGCG存在一種相互作用，值得一提的是IMP只在較低濃度下與EGCG存在此種關系。

圖3 1/(A-A0)與1/C呈味核苷酸的線性關系Fig.3 Linear relationship between 1/(A-A0) and 1/C as flavor nucleotides

2.3 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物的相互作用

2.3.1 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物相互作用的紫外吸收光譜圖 以固定BSA濃度（2.0×10?6mol/L）為背景, 添加不同濃度的呈味核苷酸后吸收值的變化如圖4所示，此系列紫外光譜中均只存在一個吸收峰，位置在278 nm處，BSA-IMP混合體系紫外吸收值聚集在0.7左右；BSA-GMP混合體系紫外吸收值聚集在0.5左右；BSA-IMP-GMP混合體系紫外吸收值隨呈味核苷酸濃度增加呈現梯度上升的趨勢。

圖4 BSA與呈味核苷酸相互作用的紫外吸收光譜圖Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of the interaction between BSA and taste nucleotide

以固定 EGCG 濃度 2.0×10?5mol/L ，BSA 濃度（2.0×10?6mol/L）為背景，添加不同濃度的呈味核苷酸的紫外吸收光譜如圖5所示，BSA-EGCG-IMP混合體系和BSA-EGCG-GMP混合體系的紫外吸收圖譜均呈現集中趨勢，BSA-EGCG-IMP-GMP混合體系的紫外吸收值明顯增大且在250 nm處吸收值的變化幅度較大，280 nm處的峰形隨呈味核苷酸濃度的增加有變緩趨勢。

圖5 EGCG-BSA絡合物與呈味核苷酸相互作用的紫外吸收光譜圖Fig.5 Ultraviolet absorption spectrum of the interaction between EGCG-BSA complex and taste nucleotide

2.3.2 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物相互作用的熒光發射圖 EGCG的酚羥基可與BSA的酰胺基團生成氫鍵使熒光強度降低，IMP、GMP的加入使其發生不同變化，可證明呈味核苷酸會與EGCG蛋白絡合物發生反應，使其穩定性發生改變從而影響熒光特性。

如圖6結果顯示，添加不同濃度的IMP、GMP對BSA的熒光強度無明顯影響，說明兩種呈味核苷酸均不與BSA發生相互作用；但當兩者混合加入后，熒光強度隨濃度的升高有規律地淬滅而不改變峰形，表明IMP-GMP混合后會與BSA發生相互作用，熒光淬滅效應是由熒光復合物形成引起的；D、E、F三圖結果顯示，BSA-EGCG-GMP混合體系中隨著GMP濃度的增加，熒光強度上升，峰的位置也向短波長方向移動；BSA-EGCG-IMP-GMP混合體系中，隨著IMP-GMP濃度的增加，熒光強度卻呈現規律性淬滅。

圖6 各滋味物質與BSA相互作用的熒光發射圖Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of the interaction between EGCG-BSA complex and taste nucleotide

2.3.3 呈味核苷酸與EGCG蛋白絡合物相互作用熒光淬滅類型，結合常數及結合位點 根據Steam-Volmer方程對混合物的淬滅類型進行判斷，呈味核苷酸對BSA熒光淬滅圖的斜率校正后分別為2.5303×1014、2.5611×1014和 6.7996×1013；呈味核苷酸對EGCG蛋白絡合物熒光淬滅圖的斜率校正后分別為 1.4570×1014、?1.94140×1014和 4.8194×1013。BSA-EGCG-GMP混合體系中斜率出現負數的原因可從圖6（E）中得到，由于 GMP的加入，破壞了BSA與EGCG的絡合，BSA與EGCG結合變小，恢復了部分熒光強度。除上述情況外，Kq均大于2 ×1010( mol/L )?1s?1，屬于靜態猝滅。通過圖7、圖8也可知，在兩種核苷酸同時存在時，不論其與BSA還是與BSAE-GCG絡合物，擬合度都更高，說明當IMP、GMP同時存在時反應更為明顯。基于以上結論，計算IMP、GMP同時存在時混合物的結合常數KA及結合位點數n（如表1），BSA+IMP+GMP的結合常數為 0.66388，結合位點數n約為0.88；BSA+EGCG+IMP+GMP的結合常數為1.10536，結合位點數n約為1.49。

表1 結合常數KA及結合位點數nTable 1 Binding constant KA and number of binding sites n

圖7 呈味核苷酸對BSA（上）及EGCG蛋白絡合物（下）熒光淬滅的Stern-Volmer圖Fig.7 Stern-Volmer plot of fluorescence quenching of flavoring nucleotides on BSA (up) and EGCG protein complex (down)

圖8 呈味核苷酸對BSA及EGCG蛋白絡合物熒光猝滅的Lineweaver-Burk圖Fig.8 Lineweaver-Burk diagram of fluorescence quenching of BSA and EGCG protein complexes by flavored nucleotides

3 討論與結論

一定程度的澀味被認為是高品質茶葉的表現[26]，但茶多酚含量過高則會降低茶湯的適口性[27]。本文通過光譜法探究呈味核苷酸與EGCG及EGCG蛋白絡合物的相互作用。紫外可見光譜結果顯示： IMP、GMP、IMP-GMP均可改變EGCG的紫外吸收特性，GMP的作用效應強于IMP，兩者混合對EGCG的作用效果最明顯。混合體系只存在一種結合方式，結合常數分別為0.01086、0.10835、0.03915，線性關系良好。推測此結果是EGCG的酚羥基與呈味核苷酸的雙鍵氧形成氫鍵，增加了芳香環上的π電子云的強度，導致增色效應。

呈味核苷酸對EGCG的蛋白絡合物也存在不同的相互作用：首先，IMP、GMP均不與BSA發生反應，但當兩者同時存在時，BSA熒光強度規律性淬滅，說明兩種呈味核苷酸同時存在時增大了熒光基團環境的疏水性，極性變小，隨濃度增大，BSA熒光強度規律淬滅，結合常數為0.66388，結合位點數約為0.88，小檗淫羊藿甙與清蛋白分子間的相互作用也存在相似結論[28]。在EGCG與BSA的絡合反應中，除發現隨著GMP濃度的增大，熒光強度增大且發生藍移外，其余均為靜態淬滅。結合紫外吸收光譜的結論，是由于GMP與EGCG相互作用后使得EGCG與BSA復合物解體，釋放出部分BSA，使得熒光強度恢復；當兩種呈味核苷酸同時存在時，隨著濃度增大，混合體系的熒光強度呈現規律性淬滅，說明在與EGCG蛋白絡合物的反應中，IMP-GMP對BSA的熒光淬滅作用為主要作用，混合體系的結合常數為1.10536，結合位點數約為1.49。

光譜法結論證明：IMP、GMP與EGCG會發生相互作用，改變EGCG的光譜特性，且只存在一種結合方式，GMP與 EGCG相互作用的效應強于IMP與EGCG的相互作用，兩種呈味核苷酸1:1混合時對EGCG影響最大。

茶湯作為一個復雜體系，本研究結果只能解釋呈味核苷酸會與EGCG及其蛋白絡合物發生相互作用，但其混合體系中具體發生反應的部位尚未清楚，在茶湯中是否會與其他物質發生其他相互作用也不得而知，本實驗只是對茶葉中呈味核苷酸的初步探究，而且由于光譜法對于復雜體系、多種物質的相互作用還無法全面解釋，今后的研究中應當繼續引入新的研究方法，解釋存在的疑問，為解釋茶葉的滋味提供理論基礎，為茶葉品質提升、茶飲料風味改善有重要作用。